2019蛋白质合成细胞工厂与微生物代谢.pptx

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1、蛋白质合成细胞工厂 与微生物代谢 研究组 张大伟 中国科学院天津工业生物技术研究所 2016-7 1研究组团队建设 2蛋白表达系统、酶制剂、医药蛋白 3维生素与氨基酸 4总结与展望 汇报内容 一. 研究组团队建设 蛋白质合成细胞工厂与微生物代谢研究组 Protein production cell factory and microbial metabolism Laboratory 以合成生物技术设计和创造微生物细胞工厂 以系统生物技术解析并提升工业微生物生产能力 张大伟，博士， 研究员 博生导师 2007年获得北京化工大学博士学位 2007-2012 美国威斯康星大学密尔沃基 分校，博士后

2、 2008-2012美国加州理工学院，博士后 2012-今，中科院天津工生所，研究员 ，博士生导师 核心技术术“ 菌株创创建 与改造升 级级” 研究组成员介绍 研究组人员共26人 u工作人员8人 u在读博士3人 u在读硕士15人 u已经毕业硕士9人 付 刚：蛋白表达系统 盖园明：酶与表达系统 李心利：蛋白分泌机制 夏苗苗：遗传与代谢 董会娜：遗传与组学 刘永飞：代谢与组学 宋国田：代谢与发酵 二、蛋白质合成细胞工厂、 酶制剂、医药蛋白 蛋白表达系统平台建立 u大肠杆菌表达系统 u枯草芽孢杆菌表达系统 u酵母表达系统 Song, Zhang*, JMB 2015 除了拥有成熟的枯草芽孢杆菌表达系

3、统，我们也在建立并完善大肠杆菌表达 系统和酵母表达系统，我们要建立能够表达蛋白，酶的综合平台。 耐高温-淀粉酶最适pH在5-7，最适温度为90-95，在喷射液化工艺中瞬间温度达105- 110，仍能有效水解淀粉，具有极好的耐热性，广泛应用于淀粉、酒精、啤酒、味精 、酿造、纺织退浆等工业上，市场需求量极大 目前高温淀粉酶生产主要依赖 芽孢杆菌，仍存在异源表达效 率低下、缺乏有效的表达系统 等不足，生产成本居高不下， 无法充分占领潜在市场 通过对枯草芽孢杆菌进行变的表达载体、表达宿主以及淀粉酶基因的 综合优化，从而提高目前高温淀粉酶的适应性和表达水平 高温淀粉酶生产主要被诺维 信、杰能科公司垄断，

4、且国 内生产厂商存在专利风险 实例一、高温淀粉酶的表达优化 高温酸性淀粉酶广泛应用于 纺织退浆、酒精、啤酒、味 精、酿造等领域 实例一、高温淀粉酶的表达优化 基因改造 DS4.0同源建模分析 确定突变位点 耐酸耐热突变体筛选 表达元件 优优化 菌种改造 强启动子优化 信号肽文库筛选 转运蛋白过表达筛选 蛋白酶敲除分析 高通量诱变筛选 A. M4突变体耐热 温度提高至 100 B. 100处理半小 时后酶活仍保 留70% C. M4突变体最适 pH值降低至6 A B C 实例一、高温淀粉酶的表达优化 基因改造 DS软件分析 确定突变位点 耐酸耐热突变体筛选 表达元件 优优化 菌种改造 强启动子优

5、化 信号肽文库筛选 转运蛋白过表达筛选 蛋白酶敲除分析 高通量诱变筛选 替换P103强启动子后表达量提高2倍 信号肽替换为 SP7后提高1.7倍 酶活达到1500U/mL 实例一、高温淀粉酶的表达优化 基因改造 DS软件分析 确定突变位点 耐酸耐热突变体筛选 表达元件 优优化 菌种改造 强启动子优化 信号肽文库筛选 转运蛋白过表达筛选 蛋白酶敲除分析 高通量诱变筛选 A B C A.G23过表达提高6倍，组合过表达再提高1.5-1.7倍 B.胞外蛋白酶敲除后表达量提高，但杂蛋白也增多 C.5L发酵罐发酵后酶活达到2500-5000U/mL 实例二、蛋白酶表达菌株的分离优化 蛋白酶是最重要的一种

6、工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽水解，在干酪生产、肉类嫩化 和植物蛋白改性中都大量的使用蛋白酶。目前中性蛋白酶及碱性蛋白酶的生产主要来源 于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。 两株野生芽孢杆菌存在限制修 饰系统（RM system），无法 利用目前常规的两步法及电转 化法进行遗传转 化，因此首先 要建立遗传转 化方法 通过培养基优化、迭代驯化、高通量诱变筛选等手段优化蛋白酶表达 同时建立野生芽孢杆菌的遗传转化技术 2株蛋白酶菌株分别为解淀 粉芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌 ，分别命名为TIB-139与TIB- 239。在此基础上进行发酵 优化及酶活测定 通过对土壤中的菌种进行芽 孢筛选+牛奶平板筛选，获 得了

7、2株明显分泌蛋白酶的 芽孢杆菌菌株 实例二、蛋白酶表达菌株的分离优化 培养基优优化 遗传转遗传转 化 方法建立 高通量诱诱 变筛选变筛选 体 系 通过优化培养基组分，摇瓶发酵酶活水平分别达到2500U/mL及 8000U/mL，比出发菌株分别提高2-4倍 实例二、蛋白酶表达菌株的分离优化 培养基优优化 遗传转遗传转 化 方法建立 高通量诱诱 变筛选变筛选 体 系 对2株蛋白酶菌株完成了全基因组测序分析工作 实例二、蛋白酶表达菌株的分离优化 培养基优优化 遗传转遗传转 化 方法建立 高通量诱诱 变筛选变筛选 体 系 利用上述HTS体系结合诱变手段筛选获 得的突变体经摇瓶发酵后 ， 蛋白酶酶活分别

8、达到5,000U/mL及10,000U/mL 实例三、异构酶DPE的分泌表达优化 DPE异构酶可催化D-果糖与D-阿洛酮糖之间的相互转化，在阿洛酮糖生物转化过程中是重 要的催化剂。D-阿洛酮糖作为一种重要的稀少糖，其安全性及其在食品中的应用已被日 本厚生省批准，可以作为保健品进行开发。 利用建立的表达元件文库及菌 株文库，针对 DPE进行特异性 优化，组合优势 性状，构建枯 草芽孢杆菌DPE高产分泌工程 菌 解决DPE异构酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达问题，同时利用文库筛 选平台对表达效率进行优化，构建初代DPE工程菌株 针对大肠杆菌表达存在的不 易提取纯化、存在安全性隐 患等问题，我们尝试利用

9、枯 草芽孢杆菌进行分泌表达 孙老师课题组成功分离了来 自瘤胃菌的DPE酶 实例三、异构酶DPE的分泌表达优化 通过平台建立的信号肽文库，针对DPE酶进行分泌表达尝试，并筛选分泌效率更高的信号 肽序列作为表达元件。结合强启动子及菌株文库筛选，获得能够高效分泌DPE的枯草芽孢 杆菌菌株。 发酵罐发酵48hr后表达量 2g/L，达到产业化水平。 MediaCell 实例四、甘露聚糖酶的分泌表达 通过平台建立的信号肽文库，针对甘露聚糖酶进行分泌表达尝试，并筛选分泌效率更高 的信号肽序列作为表达元件。结合强启动子及菌株文库筛选，获得能够高效分泌甘露聚 糖酶的枯草芽孢杆菌菌株。 发酵罐发酵48hr后表达量

10、约为 2g/L，达到行业领先水平 实例五、大肠杆菌分泌表达FGF21 FGF21（成纤维细胞生长因子）是具有降低血糖，治疗糖尿病和肥胖症的新兴医药蛋白， 我们在大肠杆菌中实现了可溶性分泌表达，并继续优化分泌表达量。 首次实现FGF21蛋白在大肠杆菌中的原型分泌表达，无需传统 包涵体-复性纯化手段，极大简化了后续纯化工艺 pET-11d-SPpelB-FGF21/ Chaperone DsbA/DsbB/DsbC/DsbD/ PpiD/PpiA/IbpAB Culture condition: 30ml/250ml flask TB medium（0.5 mg/ml L-arabinose） O

11、D6002 add 0.3 mM IPTG Cultivate time: 24h 与诺诺和诺诺德 签签署120万 合作协议协议 三、微生物代谢 维生素B12、氨基酸 维生素B12组学分析与代谢工程改造 2016/7/30 维生素B12研究背景 VB12晶体结构 发展状况： 国外： 1955 美国 222.5Kg 1968 美国 1153Kg 20世纪90年代 罗氏 2400Kg 目前 Avensis 7000Kg 国内： 华北制药、石药集团 10000Kg 应用： （1）医疗方面：治疗贫血、神 经疼等； （2）饲料方面：添加剂、提高 蛋白饲用率等； （3）其它方面：食品添加剂、 化妆品等。

12、国内VB12需求量趋势 VB12结构式 待解决问题 维生素B12又叫钴胺素，人体生长中具有重要的生理作用，既能够促 进红细胞的发育和成熟又能作为辅酶促进叶酸在体内的代谢。 虽然VB12市场需求不断增加，但微生物合成VB12的产量 较低，因为VB12合成路线比较长，调控复杂，遗传方 法缺乏，限制了产量进一步的提高。 VB12菌株改造策略 基因组分析与 组学挖掘 通过全基因组测序，解析 VB12功能途径基因，通过 比较组学，挖掘关键位点 代谢途径改造 解除酶的反馈抑制；敲除 代谢途径中支路途径，增 强主路途经；过表达代谢 途径限速蛋白。 诱变筛选 建立VB12高产菌株高通量筛 选方法，对SM菌进行

13、诱变， 再通过高通量筛选方法筛得 VB12高产菌株 优化发酵工艺 优化发酵培养基的组份和 发酵的PH、温度及溶氧等 VB12生产产菌株改造主要包括理性设计设计 和诱变诱变 高通量筛选筛选 方法同时进时进 行 利用代谢谢工程，合成生物学，组组学，高通量筛选筛选 等技术术达到提 高VB12最终产终产 量的目的。 VB12菌株性质及遗传方法建立 MS HPLC 发酵结果对比 菌落形态100* 代谢途径改造 目前维维生素B12生产产菌株呈长长杆状，发发酵周期较长较长 ，产产量较较低， 遗传遗传 操作困难难。 我们对们对 VB12菌株进进行了鉴鉴定，建立了遗传遗传 操作方法，可以有效对对 目的基因进进行

14、敲除和过过表达等操作，为为菌株改造提供了有力工具。 遗传方法建立 VB12菌株全基因组测序与功能途径分析 基因组组信息对对研究合成途径十分重要，是菌株改造的核心基础础信息。 对对VB12菌株进进行了全基因组组分析，序列拼接和基因注解。 通过对过对 VB12菌株全基因组测组测 序分析，发现该发现该 菌株中VB12合成途径 由5个基因簇调调控组组成。从ALA合成VB12，需要21步，25个基因。 VB12菌株的代谢途径 改造 对构建的一系列工程菌株进行摇瓶优化 和评价 ，筛选 到了新一代菌株。 通过过理性设计设计 ，针对针对 潜在的靶点进进行过过表达，解除riboswich，增加合 成途径通量，消

15、弱竞竞争途径。 1 2 3 4 5 通过过理性设计设计 ，针对针对 潜在的靶点进进行改造，解除riboswich，增加合成 途径通量，消弱竞竞争途径。获获得新一代生产产菌株。 代谢工程改造的菌株产量提高50% 具有产业化前景！ 微生物发酵生产维生素B12 苏氨酸菌株蛋白组学解析及生理功能鉴定 蛋白组学解析苏氨酸菌株高产机制 菌株高产抗逆机理的解析对理解和改造菌株十分重要，蛋白质组学作为一个优势的 技术，能够很好的解析高产菌株的机理和菌株发酵过程蛋白组学 通过iTRAQ技术，对苏氨酸发酵过程进行过程蛋白组学分析，利用无标记蛋白组 学技术对高产菌株的蛋白进行相对定量，找出多个靶点和进一步改造菌种策

16、略 高通量快速检测苏氨酸的方法 苏氨酸的快速检测对高通量筛选苏氨酸高产菌株具有重要意义 因此开发快速检测苏氨酸含量的方法十分重要 苏氨酸可以被苏氨酸醛缩酶催化成乙醛，乙醛可以在NADH参与下被氧化。因此建立 了苏氨酸与OD430的线性关系。该方法在SM,LB，发酵培养基，及96空板中都有较好 的应用，是一个较为有效的快速检测苏氨酸的方法。为高通量筛选提供有力工具。 苏氨酸新转运蛋白的挖掘与鉴定 增强苏氨酸的转运外排，对提高菌株生产能力，解除氨基酸对胞内的抑制和压力，具有重要的 意义。挖掘和鉴定苏氨酸新的转运蛋白，对苏氨酸增加外排的改造策略，提高苏氨酸产量，具 有重要的理论和实践意义。 我们利用

17、蛋白组学的方法，挖掘了潜在的外排苏氨酸的蛋白，对该蛋白做了遗 传学，生理学鉴定，发现蛋白Yecc-Yecs参与了苏氨酸的外排。 苯丙氨酸菌株组学解析与工程菌株 构建评价 苯丙氨酸工程菌株改造 苯丙氨酸是氨基酸类抗癌药的中间体； 苯丙氨酸是新型甜味剂阿斯巴甜重要原料； 苯丙氨酸是养殖业饲料中的必须添加组分之 一（谷物中苯丙氨酸含量较低）。 苯丙氨酸是人体必需的氨基酸之一，广泛应用于医药、化妆品、食品和饲料等行业。氨基酸又 是多种生物复合物的前体物，具有广泛的用途，利用微生物生产苯丙氨酸具有重要意义。 传统的菌株改造方法中，对菌株的高产机理的认识模糊，缺乏理性改造及高效 的快速筛选方法是限制苯丙氨

18、酸产量进一步提高的瓶颈。 全球每年氨基酸的需求量为450万吨，其中 苯丙氨酸每年超过30000吨，并且以每年10% 的速率增长； 目前文献报道最高水平为55g/L，具有巨大 的潜在提升空间。 传统的诱变筛选方法耗时久，收效低，不能 够满足现在竞争激烈的行业要求。 苯丙氨酸工程菌株改造策略 本课题组以理性和非理性改造相结合的方法进一步提高苯丙氨酸的产量，同时利用 组学手段解析苯丙氨酸高产菌住的胞内调控机制，解析高产的机理，提高产量。 苯丙氨酸菌株基因组测序分析 对诱变筛选到的高产菌株进行基因组测序，对重要代谢途径中关键酶进行分析 关键键基因的点突变变及结结构变变异对对于菌株解除反馈馈抑制、增加前

19、体和能 量供给给等都有重要作用。 苯丙氨酸高产菌株高产机理分析 高产产菌株的明显显上调调phe合成途径，和高产产菌株的相关的调调控因子的基因变变化 密切相关，从而验证验证 了高产产机制，并且找到了代谢谢瓶颈颈。 为为了解析菌株的高产产机理，分析了苯丙氨酸高产产菌株和野生型菌株 的中央代谢谢途径及苯丙氨酸合成途径蛋白组变组变 化情况。 高通量筛选系统原理示意图 转录调转录调 控因子可以通过结过结 合胞内的代谢谢物从而做出对对特定的蛋白进进行激活或 抑制的响应应，因此，转录调转录调 控因子是一种良好的的生物传传感器，筛选筛选 高产产菌 株。 筛选质粒的构建 TyrR的表达量随 Phe浓度的变化 高

20、通量筛选平台的构建 理性设计指导菌株改造 经过经过 相关途径的代谢谢改造后，苯丙氨酸在5L发发酵罐产产量达到95g/L，已 超过过文献报报道的最高水平。 通过组学分析，结合生物信息学分析结果，指导菌株改造并进行上罐发酵， 提高苯丙氨酸产量。 异亮氨酸细胞工厂改造 异亮氨酸细胞工厂构建 L-异亮氨酸是一种支链氨基酸，是人体八种必需氨基酸之一。 L-异亮氨酸是人体 激素、蛋白质合成和能量生成的原料，能够促进蛋白质合成并抑制其分解；在医 药保健、食品和饲料工业等行业，具有巨大的商业价值。 L-异亮氨酸产生菌主要有： 谷氨酸棒杆菌（ C.glutamicum） 大肠杆菌（E. coli） 利用微生物合

21、成并过量积累L-异亮氨酸是目前生产L-异亮氨酸的主要方法，利用 代谢工程方法提高其产量，构建并升级异亮氨酸高产细胞工厂具有重要意义 Food additives Pharmac- euticals Animal feed supplements L-isoleucine 发酵法生产L-异亮氨酸其 产酸量平均工业化水平： 国家产产量 g/L 提取率 中国25-3560% 日本35 60-70% 与日本相比，我国的L-异亮氨 酸生产工艺和技术相对落后 ，发酵产率和转化率低，且 产品提取收率低、品质不高 异亮氨酸细胞工厂构建策略 C.glutamicum最大化生成L-异亮氨酸的技术难题 主要有： L

22、-异亮氨酸的生物合成受其自身的反馈抑制和反馈阻遏；合成途径长且分支代谢途径多，葡 萄糖难有更多的流量流向L-异亮氨酸以及L-异亮氨酸向胞外分泌依靠载体转运 l通过比较基因组学分析高产菌株 中异亮氨酸代谢途径关键酶的突 变位点 l通过蛋白质组学分析确定异亮氨 酸代谢途径中关键酶的变化 比较基因 组学和蛋 白质组学 分析 关键酶调 控位点体 外解析 l关键酶基因表达纯化 l体外测定纯化酶的酶活和反馈抑 制的解除程度，分析调控机制 反向代谢 工程验证 l通过无痕基因修饰方法将关键突变 引入出发菌 l验证调控机制并提高异亮氨酸产量 出发菌株 诱变筛选 l MNNG诱变，筛选l 发酵工艺优化：补糖、温度

23、、 溶氧、pH l 前提物添加，活细胞催化：添 加前体如苏氨酸、天冬氨酸 l 生长因子发掘及浓度优化：生 物素等 解除反馈抑制和反馈阻遏发酵工艺优化 通过解除反馈抑制和反馈阻遏 来提高异亮氨酸的产量 通过发酵工艺优化让菌株达到 最大产能 异亮氨酸细胞工厂构建策略 l 通过比较基因组学和蛋白质组 学分析关键基因的变化情况，结合体外表 征验证调 控机理，并将解除反馈抑制或阻遏的基因引入出发菌株提高异 亮氨酸的产量。 比较基因 组学和蛋 白质组学 分析 关键酶调 控位点体 外解析 反向代谢 工程验证 出发菌株 诱变筛选 用GFP作为筛选标记筛选 受异亮氨酸诱导的启动 子，建立高通量筛选方 法 通过基

24、因组学分析发现 异亮氨酸合成途径中多 处基因发生点突变，通 过对从苏氨酸到异亮氨 酸的五个关键酶的突变 位点进行体内体外验证 解析反馈抑制或阻遏机 理，并解除反馈抑制或 阻遏 L-isoleucine Promoter Transcription Selection marker Genemutation lysC A278S S315A asd D63G D275E K286D hom G145A G376R thrB I245G ilvA F386V ilvB K31Q G118S A224S Y251H T361S ilvN H46L ilvC T304A ilvD V372E ilvE

25、 Q255H Plrp PbrnFE 异亮氨酸细胞工厂构建策略 对构建的异亮氨酸工程菌株进行筛选 ，培养基优化，发酵工艺优 化 比较基因 组学和蛋 白质组学 分析 关键酶调 控位点体 外解析 反向代谢 工程验证 出发菌株 诱变筛选 l 诱变和遗传改造筛选 l 发酵工艺优化：补糖、温度、 溶氧、pH l 前提物添加，活细胞催化：添 加前体如苏氨酸、天冬氨酸 l 生长因子发掘及浓度优化：生 物素等 生长因子浓度的优化发现生物素的最佳添加量为0.5mg/L,对前体物的 添加优化发现添加苏氨酸能提高异亮氨酸的产量 在最优生物素添加量和最优前体的添加下，5L发酵罐中异亮氨酸的 产量30g/L，转化率15

26、。 Biotin Precursor 1.Song Y, Nikoloff JM, Fu G, Chen J, Li Q, Xie N, Zheng P, Sun J, Zhang D*. Promoter Screening from Bacillus subtilis in Various Conditions Hunting for Synthetic Biology and Industrial Applications. PLoS One. 2016 Jul 5;11(7):e0158447. doi: 10.1371/journal. pone.0158447 2.Jingqi C

27、hen,Liuqun Zhao,Gang Fu,Wenjuan Zhou,Yuanxia Sun,Ping Zheng,Jibin Sun and Dawei Zhang*. A novel strategy for protein production using non-classical secretion pathway in Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 2016,15:69. DOI: 10.1186/s12934-016 -0469-8. 3. Huina Dong, Sha Li, Miaomiao Xia, Ping

28、 Zheng*, Dawei Zhang*, Jibin Sun. A Newly Isolated and Identified Vitamin B12 Producing StrainSinorhizobium meliloti 320 Bioprocess and Biosystems Engineering. 2016. DOI：10.1007/s00449-016-1628-3. 4.Jingqi Chen, Yuanming Gai, Gang Fu, Wenjuan Zhou, Dawei Zhang*, Jianping Wen. Enhanced extracellular

29、production of -amylase in Bacillus subtilis by optimization of regulatory elements and over-expression of PrsA lipoprotein. Biotechnol Lett. 2014 Dec 17. 5.Huan Fang, Huina Dong,Tao Cai, Ping Zheng, Haixing Li, Dawei Zhang* and Jibin Sun. In vitro optimization of enzymes involved in precorrin-2 synt

30、hesis using response surface methodology. PloS One. 2016 accepted. DOI： 10.1371/journal.pone.0151149. 6.Jingqi Chen, Gang Fu, Yuanming Gai, Ping Zheng, Dawei Zhang* and Jianping Wen. Combinatorial Sec pathway analysis for improved heterologous protein secretion in Bacillus subtilis: identification o

31、f bottlenecks by systematic gene overexpression. Microbial Cell Factories. 2015, 14:92. (Highly accessed) 7.Huina Dong, Yongfei Liu, Xin Zu, Ning Li, Feiran Li, Dawei Zhang*. An enzymatic assay for high- throughput screening of cytidine-producing microbial strains. PLoS ONE. 2015. DOI:10.1371/ journ

32、al. pone.0121612. 2014.1-2016.7发表SCI论文14篇 8. Yanan Liu, Qinggang Li, Ping Zheng*, Zhidan Zhang, Yongfei Liu, Cunmin Sun, Guoqiang Cao, Wenjuan Zhou, Xiaowei Wang, Dawei Zhang, Tongcun Zhang, Jibin Sun* and Yanhe Ma. Developing a high-throughput screening method for threonine overproduction based on

33、an artificial promoter Microbial Cell Factories. 2015, (2015) 14:121 9.Yanfei Zhang, Qinglong Meng, Hongwu Ma*, Yongfei Liu, Guoqiang Cao, Xiaoran Zhang, Ping_Zheng, Jibin Sun, Dawei Zhang, Wenxia Jiang, Yanhe Ma. Determination of key enzymes for threonine synthesis through in vitro metabolic pathwa

34、y analysis, Microbial Cell Factories. 2015. 14:92 .3. 10. Yafeng Song, Jonas M. Nikoloff, Dawei Zhang*. Improving Protein Production on the Level of Regulation both of Expression and Secretion Pathways in Bacillus subtilis. J. Microbiol. Biotechnol. 2015. DOI: 10.4014/jmb.1501.01028. 11. Huina Dong,

35、 and Dawei Zhang*. Current development in genetic engineering strategies of Bacillus species, Microb Cell Factory.2014, 13: 63. (Highly accessed) 12. Haifeng Zhang, Gang Fu, Dawei Zhang*. Cloning, characterization and production of a novel lysozyme by different expression hosts. J. Microbiol. Biotec

36、hnol.2014 ; 24(10): 14051412 13. Huina Dong, Xin Zu, Ping Zheng, Dawei Zhang*. A rapid enzymatic assay for high-throughput screening of adenosine-producing strains. Microbial Biotechnology. 2015.doi: 10.1111/ 1751- 7915.12189. 14. Yongfei Liu, Feiran Li, Xiaoran Zhang, Guoqiang Cao, Wenxia Jiang, Yu

37、xiu Sun, Ping Zheng, Dawei Zhang*. A fast and sensitive coupled enzyme assay for the measurement of L-threonine and application to high-throughput screening of threonine-overproducing strains. Enzyme and Microbial Technology 2014. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2014.08.008. 第1,2篇MCF： Highly accessed 第3篇MC

38、F：被“生物催化剂设剂设 计计与服务务改造”报报道 申请专利11项 (2013-2016) 张大伟，盖园明，付刚。一种提高淀粉酶表达量的通用型枯草芽孢杆菌整合表 达载体。申请号：20140784005.8. 张大伟，张海峰。一种地衣芽孢杆菌溶菌酶及其生产方法和应用。申请人：中 国科学院天津工业生物技术研究所。申请号:201310168518.1 张大伟，刘永飞，李斐然，张笑然，姜文侠，郑平。一种快速检测发酵液中苏 氨酸含量的方法。申请人：中国科学院天津工业生物技术研究所。申请号 :201410339765.8 张大伟，董会娜，祖昕。一种腺苷高产微生物菌种的高通量筛选方法。申请人 ：中国科学院天

39、津工业生物技术研究所。申请号: 201410474529.7 张大伟，董会娜，祖昕。一种胞苷高产微生物菌种的高通量筛选方法。申请人 ：中国科学院天津工业生物技术研究所。申请号: 201410492453.0 张大伟，李莎，夏苗苗，房欢，周文娟，郑平。一种苜蓿中华根瘤菌的组合物 及其应用.申请号: 201410529336.7 张大伟，陈景奇，朱玥明，付刚，孙媛霞。一株高效分泌D-阿洛酮糖 3-差向异构 酶的基因工程菌株、构建方法及其应用。申请号：201610051547.3。 申请日： 2016年01月26日 张大伟，陈景奇，赵留群，孙际宾。一种非经典分泌蛋白及其在蛋白分泌表达中 的应用。申请

40、号：201610056025.2。 申请日：2016年01月26日 张大伟，付刚，宋亚凤。 一株高产碱性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用。申 请人：中国科学院天津工业生物技术所。 201510750222.x 2015-11-09 张大伟，付刚， 岳洁。 一株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用。申请 人：中国科学院天津工业生物技术研究所。201510750221.5 2015-11-09 张大伟， 付刚 ，岳洁， 郑平。一种包含麦芽糖启动子的载体以及麦芽糖启动子 突变体。申请人：中国科学院天津工业生物技术研究所 。 请请多提出宝贵贵意见见！ 官兵一致同甘苦， 革命理想高于天！ 致致致致 谢谢谢谢