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1、猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗的研制,王春来 细菌动物病创新团队 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,猪病论坛,深圳 2014.04.29,概 述,病 原 菌：胸膜肺炎放线杆菌（APP） 疾病特征：肺脏出血、坏死以及与胸膜 发生纤维素性粘连 危 害：世界范围内的多发病、常见病 规模化猪场猪呼吸系统综合征 （PRDC）的主要病原之一,急性爆发：致死率可高达100 慢性感染：高发病率，患猪表现为生长迟 滞、饲料利用率低、日增重明显 下降等，可谓损失巨大。 APP 包括15个血清型，各个血清型间毒力差 异较大，但引起的疾病症状相同。,主要毒力因子： Apx毒素（ Apx、Apx、Apx 和Apx ） 荚膜多糖
2、（CP） 脂多糖内毒素（LPS） 外膜蛋白（OMP） 转铁蛋白结合蛋白（Tbp） 粘附素（Adhesin） 蛋白酶（Protease） 铁摄取调控因子（Fur）,我国APP疫苗研究进展,灭活苗 (全菌体通过加热或用甲醛灭活后制备的一种疫苗) 血清1、2、7型三价苗（武汉科前） 血清1、3、7型三价苗（中农威特） 血清1、7二价苗（山东华宏） 亚单位疫苗（APP主要毒力因子及保护性抗原为主要组分的疫苗） 保猪利爱普克（ Porcilis APPR , Intervet）（Apx Apx Apx OMP ） 哈尔滨兽医研究所 （目前处于临床前研究阶段） 弱毒活疫苗 （人工缺失或灭活某一种或几种毒力
3、因子致弱的活疫苗） 华中农业大学 （APP1apxICapxIICORF1，注册新兽药证书） 哈尔滨兽医研究所（APP7clpPapxIICfur，申报转基因安全评价） Ghost（菌影）疫苗 （细菌裂解后剩下的空壳制备的一种疫苗） 哈尔滨兽医研究所 目前处于临床前研究阶段,猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗的研制,Ghost（菌影）简介,近年来出现的一种新概念、新技术 一种没有细胞浆和核酸的空细菌体 利用噬菌体X174 裂解基因E 在革兰氏阴性细菌中表达后，该基因编码蛋白在细菌细胞膜和胞壁上可形成穿膜孔道，在渗透压的作用下使菌体破裂，细菌内细胞浆和核酸等成分通过此孔道被排出，形成的一种空的细
4、菌外壳，即为“菌影”，也称“菌蜕”。,Ebensen et al., J Immunol, 2004,Witte et al., J Bacteriol, 1990,扫描电镜,透射电镜,Ghost 制作流程示意图,28 42,目前，国外已经成功制备成菌影的细菌包括大肠杆菌、鼠 伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、支气管败 血博特氏杆菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆 菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、绿脓杆 菌、恶臭假单胞菌等。说明只要具备合适的遗传操作系统，基 于噬菌体裂解基因的裂解系统几乎适用于所有的革兰氏阴性 细菌。目前我们实验室已成功制备了胸膜肺炎放线杆菌
5、和副猪 嗜血杆菌的菌影。,Ghost疫苗的优点,是一种基因工程死苗，不含任何核酸成分，安全； 由于ghost疫苗利用的是基因工程方法使菌体裂解灭活，没有经过物理或化学的变性过程（如甲醛灭活处理），所以菌体表面构象与活菌相似，提呈的是天然抗原决定簇，免疫原性好； 可以激发特异的体液免疫和细胞免疫应答；交叉保护能力优于灭活苗； 优良的佐剂效应，菌影细胞表面含有脂多糖和肽聚糖，具有佐剂作用；诱导的免疫反应水平达到或超过福氏完全佐剂； 生产工艺简单，不需添加佐剂，可冻干保存，不需冷链条件运输和保存。,App及菌影透射电镜照片,正常APP细菌,APP 菌影,重组菌株APP1（pGZRS-E）,正常APP
6、细菌,APP 菌影,App及菌影扫描电镜照片,正常剂量及大剂量免疫情况,App ghost对断奶仔猪的安全性试验,App ghost不同剂量免疫对仔猪体温的影响,App ghost不同剂量免疫对仔猪体重的影响,App ghost对怀孕母猪的安全性试验,正常剂量及大剂量免疫情况,App ghost不同剂量免疫对怀孕母猪体温的影响,App ghost免疫效力试验,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,* 与对照比相比差异显著（P0.05）；* *与对照比相比差异极显著（P0.01）； * * *与对照比相比差异极显著（P0.001）； 与灭活苗组相比差异显著（P0.05） ； 与灭活苗组相比差异
7、极显著（P0.01）,IgG,免疫后抗体动态变化,攻毒,细胞因子产生情况,IFN-,*,*,*,*,*,*,* 与对照比相比差异显著（P0.05）；* *与对照比相比差异极显著（P0.01）； * * *与对照比相比差异极显著（P0.001）； 与灭活苗组相比差异显著（P0.05） ； 与灭活苗组相比差异极显著（P0.01）,*,*,*,*,*,*,IL-4,攻毒,攻毒,* 与对照比相比差异显著（P0.05）；* *与对照比相比差异极显著（P0.01）； 与灭活苗组相比差异显著（P0.05）,*,*,*,*,*,T淋巴细胞亚类,攻毒,攻毒,攻毒保护情况APP1攻毒,：125%肺损伤； ：265
8、0%肺损伤； ：5175%肺损伤；：76100损伤,攻毒保护情况APP5攻毒,：125%肺损伤； ：2650%肺损伤； ：5175%肺损伤；：76100损伤,攻毒保护情况APP7攻毒,：125%肺损伤； ：2650%肺损伤； ：5175%肺损伤；：76100损伤,临床病理变化,App ghost免疫组,灭活苗免疫组,对照组,肺脏组织病理变化,App ghost免疫组,灭活苗免疫组,对照组,肺脏免疫荧光检测,对照组,灭活苗免疫组,App ghost免疫组,hilar lymph node,Lung,Spleen,*,*,*,*,*,*,* 与对照比相比差异显著（P0.05）；* *与对照比相比差
9、异极显著（P0.01）； 与灭活苗组相比差异显著（P0.05）,脏器细菌载量,小结,猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗安全性好，接种后无任何不良反应。 猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗通过肌肉注射免疫猪后，可刺激机体产生较强的体液免疫和细胞免疫，对App强毒菌的攻击可产生良好保护，明显优于灭活苗免疫组和对照组。 猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗已与动物用生物制品国家工程研究中心（哈尔滨）达成了合作开发的意向 很多生物制品企业对猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗感兴趣，并初步达成了成果转化的意向。,副猪嗜血杆菌病ghost疫苗的研制,正常Hps,Hps ghost,Hps及菌影透射电镜照片,
10、试验进展,基本完成了实验室研究工作，正在进行转基因安全评价，已完成中间试验。结果表明，Hps ghost疫苗对靶动物猪是安全的，已申报环境释放并获得批文； 初步动物免疫试验结果表明， Hps ghost疫苗具有良好的免疫效力，能够保护猪抵抗Hps强毒菌的攻击，保护效力要优于灭活疫苗。,申请和获得的专利,重排噬菌体溶菌基因及其打孔载体和在制备疫苗中的应用(ZL 2009 1 0018379.5） 增强噬菌体溶菌基因打孔效率的DNA序列及其应用（ZL 2009 1 0018380.8） 突变的噬菌体裂解基因E、含有该裂解基因的裂解质粒载体和在制备菌影疫苗中的应用（申请号：201310409238.
11、5） 一种制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法及其产品和应用（申请号：201310409237.0）,获得的转基因安全证书及安全评价,表达溶解基因E和温敏调控基因cIts857的重组放线杆菌Shope4074（pGZRS-E）基因工程菌影疫苗的安全证书（农基安证字（2011）第014号） 表达溶菌基因E和温敏调控基因cIts857的重组副猪嗜血杆菌疫苗rHps-E在黑龙江省的环境释放（农基安审字（2012）第035号）,展 望,Ghost疫苗兼具灭活苗的安全性和活苗的有效性； 良好的交叉保护性； 可工业化生产，工艺简单，不需冷链条件运输和保存。 前景光明，菌影疫苗的研发和推广应用必将带来细菌疫苗的一场革命。,