疾病产生的分子基条础ppt课件.ppt

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1、1,第十一章 疾病产生的分子基础 Chapter11 Molecular Basis of Diseases Development,2,遗传病由一或几个基因及其编码产物蛋白质的异常导致；常见复杂疾病如恶性肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、心脑血管、高血压等发生和发展都涉及到更多蛋白质及其复合物的结构、功能和相互作用异常。 疾病的本质是蛋白质功能紊乱，基本原理是各种原因引起蛋白质质和量的改变。,3,1.基因结构的改变； 2.受细胞内调节因素或其它因素影响使基因的表达发生改变； 3.外来的致病基因； 4.蛋白质翻译后加工及蛋白质降解发生变化。,蛋白质功能紊乱的原因各不相同，具有不同分子机制。,4,第

2、一节 基因结构改变与疾病 第二节 细胞间信号异常与疾病 第三节 细胞内因素与疾病 第四节 翻译后加工运输障碍与疾病 第五节 蛋白质降解异常与疾病 第六节 病原微生物基因引起的疾病 第七节 疾病分子机制的研究策略,5,第一节 基因结构改变与疾病 一、基因突变 二、基因突变的遗传学效应 三、结构基因变异导致的疾病 四、调控序列变异导致基因表达水平变化,6,复制错误 碱基脱落或部分脱落 活性氧簇（ROS）,紫外线 电离辐射,烷化剂 碱基类似物 修饰剂,DNA,DNA突变的原因,7,一、基因突变的多种类型,点突变是单个碱基的替换：转换和颠换 缺失是一个或多个核苷酸的丢失 插入是一个或多个核苷酸的增加

3、倒位是一段核苷酸序列染色体位置的改变 基因突变还分为配子突变与体细胞突变 动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变,8,例脆性X综合征,“CCG”重复发生在FMR1（脆性X智力低下基因1）的5 非翻译区，拷贝数不稳定。 850拷贝 (正常人) 52200拷贝 (携带者) 2001000拷贝 (患者),9,强直性肌营养不良 3非翻译区CTG拷贝数过度增加； Huntington舞蹈病 编码区CAG拷贝数过度增加； Friedreich共济失调症 内含子CAA拷贝数过度增加。,10,1. 错义突变（missense mutation）指DNA改变后mRNA中相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，

4、使蛋白质中的氨基酸发生改变。,二、不同的基因突变引起不同的遗传效应,有些错义突变不影响蛋白质或酶的生物活性，不表现出明显的表型效应。,11,2.无义突变 (nonsense mutation),亮氨酸的密码子UUA，中间的U变为A这样一个碱基变化就会成为（终止密码子）UAA。,酪氨酸的密码子是UAC，置换突变使UAC变为密码子UAG后翻译便终止。,UAG、UGA、UAA 终止密码子,12,3.同义突变(synonymous mutation)：同义密码子互换性变化, 所编码的氨基酸不变。,例如：CUU CUC CUG 亮氨酸,13,4.移码突变(frame-shift mutation) 1)

5、密码子缺失或插入 2)整个基因或基因大片段缺失,14,a.密码子缺失或插入,CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser,CTG ACT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Glu Glu Lys Ser,CTG ACT CC G GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Lys Ser,C CT CCT GAG GAG AAG TCT Pro Pro Glu Glu Lys Ser,15,b.阅读框改变,CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Glu L

6、ys Ser,TG ACT CCT GAG GAG AAG TCT,TGA CTC CTG AGG AGA AGT CT,CT ACT CCT GAG GAG AAG TCT CTA CTC CTG AGG AGA AGT CT Leu Leu Leu Arg Arg Ser,插入或缺失带来的无义突变,CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser,16,5.融合突变(fusion mutation) 细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基因间错位配对, 产生两种含不同等位基因的染色体。,17,18,19,白血病中部分常见的融合基

7、因,20,6.基因突变影响 hnRNA 的剪接,基因突变发生在 hnRNA 的一级结构上特定的剪接位点上，形成新的剪接位点或使正常剪接位点消失，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。,21,真核生物基因的剪接位点： 由内含子的5端“GT”和3端“AG”，及内含子和外显子内的其它调控元件共同决定。,22,例：家族性孤立性生长激素缺乏型遗传病 由于GH-1基因的EXON上第5nt由GA，破坏一个ESE，使EXON被跳过，而最终造成编码蛋白缩短，影响功能。,23,转入了人缺陷型 的GH-1基因,利用RNAi使导入基因沉默,2007年,24,三

8、结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病,结构基因发生改变会改变蛋白质的一级结构，进而改变蛋白质的理化性质。,25,1.蛋白质结构变化引起的疾病 （1） 血红蛋白病 (hemoglobinopathy),26,血红蛋白结构,血红蛋白是由4条肽链（两个和两个链）组成的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链，都结合一个血红素。,27,血红蛋白病镰刀形细胞贫血症,28,29,血红蛋白病分子基础,30,血红蛋白病分子基础,31,（2） 家族性高胆固醇血症 LDL 受体基因变异，导致其编码蛋白结构异常，功能下降或完全丧失。 配体结合结构域，由LDL受体蛋白N端292个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸。该结构中有7个由4

9、0个氨基酸残基组成的重复序列(天冬-半胱-X-天冬-甘-丝-天冬-谷)，每个重复序列中含有6个半胱氨酸残基，全部42个半胱氨酸。,32,2.蛋白质合成量变化引起的疾病,33,人珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构,34,珠蛋白基因的表达在时空上受到遗传因素的精确调控，表现为以下特点： 组织特异性 发育阶段特异性 协同性,35,-地贫基因缺失类型,1,2,正常,基本 正常,+,轻度 贫血, + +,轻度 贫血,0,高度贫血, + 0,Hb Barts 综合征, 0 0,36,珠蛋白结构基因突变抑制珠蛋白合成使珠蛋白量减少甚至完全缺失,引起-地贫,第17位赖氨酸密码子AAG (Lys) TAG, 发生无义

10、突变,引起0地贫; 珠蛋白基因的编码顺序内插入或缺失1、或个核苷酸，会使突变点以后的读码框遭到破坏，往往造成-珠蛋白肽链合成提前终止，而引起0地贫。,37,四、调控序列变异导致基因表达水平变化,顺式作用元件的基因突变，会降低珠蛋白基因的转录，使珠蛋白合成减少，引起+-地贫。,TATA盒：-32（CA)、-30(TC)、-29(AG)、-28(AG)。 CAAT盒：-101、-92、-88、-87、-86等位点的点突变。,38,启动子和外显子1之间大于10kb的缺失; 另一种是启动子和外显子1之间大于6kb的缺失。 两种突变都使LDL受体基因的表达能力完全丧失。,LDL受体启动子变异,39,一些

11、内含子的变异也会影响蛋白质的合成，使体内相应蛋白质含量减少或缺失。 Apo B100 基因内含子的第一个碱基会发生GT突变，突变基因转录后生产的hnRNA，会影响Apo B100 mRNA的正常剪切。,40,第二节 细胞间信号异常导致基因 表达异常引起疾病,细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，协调调节彼此的代谢。 基因表达也受到细胞间信号的调控。,41,AFP 接受异常细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素,胚胎发育过程中, AFP增强子激活,出生后, AFP沉寂子处于活化状态。 在异常细胞增殖信号的作用下, c-myc、c-fos、c-jun等癌基因表达异常增加,其表达产物与

12、 AFP基因顺式作用元件结合,激活 AFP基因表达。 AFP与其膜受体结合，影响TNF及其受体表达，导致肝癌细胞逃避免疫监视，并促进其生长。,42,粉尘刺激 肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞 分泌TGF-1 成纤维细胞 促细胞分裂和ECM 蛋白基因表达 ECM 蛋白成份合成和分泌增加（各型胶原蛋白、IL-1、TNF等） ECM病理性蓄积，矽肺发生,尘肺：长期吸入大量含游离二氧化硅粉尘引起的以肺纤维化为主要病变的疾病,43,第三节 细胞内因素导致基因 表达异常引起疾病,异常的细胞内信号 持续高血糖引起的糖尿病心肌病 高血糖 DAG PKC ACE Ang 心肌重塑、心肌肥大。,44,异常的DNA甲基化

13、（不同的DNA甲基化模式形成不同的表观遗传特征） hCG5转录起始区低甲基化非滋养层细胞hCG 受体结合 cAMP Tumor ,45,Proteins complexed with DNA allow for more “open” structure; can be transcribed.,Methylation leads to change in chromatin structure; more condensed state is transcriptionally inactivegenes are “off ” ,46,人绒毛膜促性腺激素(hCG)在妊娠早期维持黄体功能、促进

14、妊娠进行和胎儿性别分化等； 肿瘤细胞中，hCG基因5转录起始区发生去甲基化或低甲基化，形成非滋养层细胞中异位表达，具有类似与生长因子作用，激活cAMP旁路信号途径，独立地调节肿瘤细胞增殖、分化和生长。,47,第四节 翻译后加工运输障碍与疾病,新合成的蛋白质翻译后加工主要过程： 去信号肽、基团修饰、折叠、亚基聚合、运输（至靶作用部位）等,48,白化 Albinism,49,酪氨酸酶与型泛素性白化病,酪氨酸酶催化结构域点突变可以使酪氨酸酶的活性降低甚至消失,黑色素合成减少或不能合成,导致型泛素性白化病; 酪氨酸酶催化结构域以外的点突变也能导致色素缺失,蛋白质不能正确折叠.没有正常折叠的酪氨酸酶不能

15、从内质网输出而滞留在内质网,无法完成其成熟及运输过程。,50,蛋白转运异常,酪氨酸酶,P蛋白,高尔基体,黑色素体,P蛋白基因突变,黑色素合成障碍 引起型泛发性 白化病,内质网,酪氨酸酶与型泛素性白化病,51,第五节 蛋白质降解异常与疾病,52,蛋白质降解途径 溶酶体：降解细胞吞入的胞外蛋白质 泛素-蛋白酶体：降解胞内泛素化的蛋白质 泛素(ubiquitin, Ub) E1(泛素激活酶) E2(泛素结合酶), E3(泛素连接酶) 26S蛋白酶体(proteasome),蛋白的降解,53,54,泛素-蛋白酶体系统活性被异常抑制或激活均可导致机体紊乱。,2004 年诺贝尔化学奖,阿龙切哈诺沃(Aar

16、on Ciechanover),阿夫拉姆赫什科(Avram Hershko),欧文罗斯(Irwin Rose),55,高血脂:载脂蛋白的过度降解,载脂蛋白（apolipoprotein, apo):与脂质结合的运输载体 泛素-蛋白酶体系统在维持正常载脂蛋白含量中起到重要的作用，该系统功能障碍，会导致载脂蛋白含量异常。 Apo A, Apo B100, Apo E, etc.,56,阿尔茨海默病:蛋白酶体活性的抑制,阿尔茨海默病（Alzheimers disease, AD）是一种中枢神经系统退行性病变的疾病。临床上首先表现为近期记忆力降低,继而表现持续性智能衰退、失语、判断推理能力丧失,以及运

17、动障碍等。AD最显著的神经病理组织学特征是老年斑和神经原纤维缠结。现已发现,-淀粉样蛋白在老年斑的形成过程中起十分重要的作用 。,57,第六节 病原微生物基因引起的疾病,感染引起机械或生物学损伤； 争夺营养造成营养缺乏； 毒素引起细胞代谢功能异常； 基因整合到宿主基因组，造成基因结构改 变和表达异常。,58,第七节 基因结构和表达与疾病的研究策略,1.通过基因结构分析确定基因变异,3.通过功能学研究确定致病基因 转基因技术、基因敲除、 反义技术、基因诱导超表达,2.基因表达水平分析 差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析,59,测序：双脱氧自动化序列分析 SSCP：单链构象多态性分析 RFL

18、P：限制性酶切长度多态性 DNA芯片 AS-PCR:等位特异性PCR ASO杂交：寡核苷酸斑点杂交 MS-PCR：甲基化PCR DGGE etc.,一、基因结构分析,60,基本原理: 在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，即可确定错配的位置。,1.核糖核酸酶切分析（RNase cleavage）,61,？,62,63,电泳分离,64,缺点： 当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割； 分析DNA的一条链，突变检出率为 30%；同时分析DNA的两条链，突变检出率为 70%；

19、 需要制备特异性的RNA探针,65,2.杂合双链分析法 （heteroduplex analysis, HA）,直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率。,66,杂合双链分析（ heteroduplexes analysis）,67,缺点：只适合200300bp的片段; 不能确定突变的具体位置; 检出率一般只有80%左右。,68,3. 化学切割错配法 （Chemical cleavage of mismatch, CCM）,基本原理： 将待测含

20、DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合后，变性处理，进行杂交。 在异源杂合的双链核酸分子中： 错配的C能被羟胺和哌啶切割， 错配的T能被四氧化锇切割， 变性凝胶电泳可确定是否存在突变。,69,特点： 突变检出率高； 如使用荧光检测系统，灵敏度较高； 可检测长度达 2Kb的核酸片段； 步骤多、费时、有毒；,70,4.酶促切割错配 (enzyme mismatch cleavage),酶：T4内切核酸酶 VII 识别的序列：DNA:DNA异源杂合分子 优点：最长检测片段可达1.5kb，省去体外合成RNA探针的步骤 缺点：会产生非特异性切割，对错配位点的识别也不是100%,71,二、基因

21、表达水平分析,Northern杂交 定量RT-PCR 基因表达芯片 差异显示技术 抑制性消减杂交 基因表达系列分析,72,1.差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR),在不同的生长时期、在个体发育与分化不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因的差异表达（differential expression）。,原理：利用两组特殊引物对差别表达的基因进行扩增。,73,3端引物：利用mRNA的poly A尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，poly

22、 A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合： 5-AGAAAAAAA- 3 5-CGAAAAAAA- 3 5-GGAAAAAAA- 3 5-TGAAAAAAA- 3 5-ATAAAAAAA- 3 5-CTAAAAAAA- 3 5-GTAAAAAAA- 3 5-TTAAAAAAA- 3 5-ACAAAAAAA- 3 5-CCAAAAAAA- 3 5-GCAAAAAAA- 3 5-TCAAAAAAA- 3,74,这些引物由1112个T及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。 这种引物称锚定引物。,75,为10个碱基随机

23、排列组成的随机引物。 为了能对更多的基因进行分析，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5随机引物。,5端引物,76,5 ,MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3 ,Poly(A) RNA,5 T12MN 3 锚定引物,逆转录,5 ,MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3 ,3,M N TTTTTTTTTTTT 5 ,变性,5 ,MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3,3,M N TTTTTTTTTTTT 5 ,退火,5 T12MN 3锚定引物 寡核苷酸随机引物,3,M N TTTTTTTTTTTT 5 ,延长,dNTP、Taq聚合酶,3,M N TTTTTTTTTTTT 5 ,5 ,

24、MNAAAAAAAAAAA 3,变性、退火、延伸,电泳,显示,T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C),启动cDNA第一链合成,不同长度的PCR产物,回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对,随机结合到cDNA链上,77,差异显示技术特点 简单易行 快速 实验样品需要量低 多能性 对低丰度mRNA的富集效率低、假阳性,78,2. 抑制性差减杂交 (SSH) - Diatchenko L, et al. PNAS 1996; 93:6025-6030 Suppression subtractive hybridization: a method for generating differ

25、entially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries,79,原理 a. SSH是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链DNA退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链DNA，使不同丰度的单链DNA得到均衡； b.抑制PCR利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。,80,方法 提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经识别 4 碱基的限制

26、性内切酶Rsa切割 实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头 进行2轮差减杂交和PCR 获得富集的目的基因,81,检测组 (Tester) 含目的基因cDNA，加接头 驱逐组 (Driver) 不含目的基因cDNA，不加接头 * 接头含PCR 引物 正向SSH: 易感者(Tester) + 不易感者(Driver) 易感者特异表达或高表达基因 反向SSH: 不易感者(Tester) + 易感者(Driver) 不易感者特异表达或高表达基因,82,抑制性 差减杂交 (SSH) 流程图,83,优点 采用两次差减杂交和PCR，保证了高特异性 (假阳性率可降至6); 在杂交过程中可使不同丰度基因均

27、衡化，获得低丰度差异表达基因;操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法。 缺点 起始材料需要 g 级量mRNA; SSH差减克隆片段较小，获取cDNA全长序列有一定难度。,84,Elkeles A, et al. Mol Cell Biol ，1999; 19: 2594-2600 The c-fos proto-oncogene is a target for transactivation by the p53 tumor suppressor 采用SSH法证实, 在p53介导的细胞凋亡过程中，c-fos是p53转录刺激的靶基因,从而提供了这两种重要调控蛋白相互作用的直接依据。,抑制性差减

28、杂交(SSH),85,Kostic C and Shaw PH. Oncogene ，2000; 19:3978-3987 Isolation and characterization of sixteen novel p53 response genes 通过SSH比较了p53缺失和含p53的结肠癌细胞株间基因差异表达，发现16个p53依赖的下游靶基因。,抑制性差减杂交(SSH),86,3. 基因表达系列分析 (Serial Analysis of Gene Expression, SAGE),是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法(Velculescu et al., 1995)。

29、SAGE原理: 分离每个转录本特定位置的较短单一的序列标签（约9-11个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。,87,Serial analysis of gene expression (SAGE) 技术流程,88,三、基因功能的研究,转基因技术 基因打靶 反义寡核苷酸技术 反义RNA技术 核酶技术 RNA干扰技术 基因诱导超表达技术,反义技术,89,1. 转基因技术,指在生物基因组中带有插入或整合的外源基因，生物个体能将它传给后代，并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。,90,采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵

30、细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。,转基因 被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) 目的基因的受体动物,91,基本方法,显微注射法 胚胎干细胞法(embryonic stem cells,ES细胞) 逆转录病毒感染法 精子载体法 转基因动物中外源基因的检测 染色体及基因水平：斑点杂交、Southern杂交、PCR 转录水平：Northern杂交 蛋白质水平：Western印迹,92,转基因动物操作技术流程,获取外源目的基因 含有外源目的基因的重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物 转基因胚胎的发育

31、及鉴定 筛选所得的转基因动物,简明操作步骤,93,转基因动物实例一,超级奶牛普通奶牛的三倍大 （英国）,94,转基因动物实例二,东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪 绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆,95,转基因动物实例三,转绿色荧光蛋白的兔,96,转基因动物实例四,正在进行转基因山羊的实验,乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊,上海交通大学医学遗传研究所,97,2. 基因打靶(gene targeting),通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。 基因敲除(gene knockout)：定向敲除 基因敲入(gene knockin)：定

32、向替代,98,Marrio Capecchi于八十年代末在Utah大学发展起来。实验动物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就称为敲除小鼠(knockout mice)。 基因敲除技术是研究基因功能的一项非常有用的技术(遗传病研究、研究特定基因的细胞生物学活性以及研究发育调控的基因作用）。 基因敲除是一套组合技术，包括基因重组、细胞分离培养、转基因等。,99,基因打靶的必备条件,胚胎干细胞(ES细胞) 能在体外培养，保留发育的全能性 打靶载体 Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kin

33、ase),100,基因敲除的基本程序,打靶载体的构建 打靶载体导入ES细胞：重组置换 基因敲除ES细胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宫中 嵌合体的杂交育种,101,102,美国犹他大学 Mario R. Capecchi,美国北卡罗来纳州大学 Oliver Smithies,英国卡迪夫大学 Martin J. Evans,2007年诺贝尔生理学或医学奖:基因打靶,103,3. 反义技术,104,核酶技术确定基因在疾病中的作用,（1） RNA分子，催化核糖体RNA中内含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，还可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA链的复制等。 （2）优点:其底物的碱基配对特异性

34、。核酶与底物结合常形成“发夹”结构或“锤头”结构。 （3）设计核酶特异性地结合于靶点，以其本身酶活性进行剪切。,105,核酶的作用机制,106,与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。,107,反义RNA技术 antisense RNA,自身没有编码功能，但能与目标RNA特别是mRNA的特定区域互补结合的一类RNA; 自然存在，或人工生物合成。,108,反义寡核苷酸技术 (antisense oligonucleotide, ASON) 人工合成的能与目的DNA或RNA

35、互补的寡核苷酸（15-20nt）。,肽核酸 (peptide nucleic acid, PNA) 核酸分子中的磷酸二酯键骨架被酰胺键骨架取代，具有更强的稳定性。,109,4. RNA干扰（RNA interference，RNAi）,内源性或外源性双链RNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。,110,共抑制现象的发现,研究的早期线索早在20年前,来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组Rich Jorgensen和同事,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现:将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加

36、深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen将这种现象命名为共抑制(cosuppression),因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象,后来发现在其他许多植物中,甚至在真菌中也有类似的现象。,111,112,RNAi 现象的发现,线虫（C. elegans),1995年康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues,+,Par-1 Gene Disruption,Expression,Down,Double Strand RNA,线 虫， 果 蝇 微生物， 植 物,113,1998年被解开华盛顿卡耐基研究院的

37、Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首次使用双链dsRNA高效地特异性阻断同源基因的表达。 实验表明在线虫中注入双链不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为干扰。,114,dsRNA,Dicer cleavage of dsRNA,siRNA,RNAi 抑制基因表达的机理,Cell Membrane,115,5. 基因诱导超表达技术,将目的基因全长序列与高活性启动子或组织特异性启动子融合，经过转化后，在诱导剂的作用下或在特定的组织细胞中，目的基因超表达，相应的基因表达产物大量积累。比较加入诱导剂前后的表型变化，从

38、而确定目的基因在疾病发生中的作用。,116,Thank you,117,附1、疾病相关基因的功能克隆和定位克隆,1 疾病相关基因 2 功能克隆 3 定位克隆,118,1、疾病相关基因与疾病,单基因病 (一个基因位点上的缺陷) 多基因病 (涉及两个以上的基因位点) 染色体病 (染色体结构与数目的改变) 获得性基因病 (遗传易感性或病原微生物),119,、功能克隆(Functional cloning),以获得的蛋白质表达及功能信息为线索，分离鉴定出相应的基因，叫未知基因的功能克隆。,120,功能克隆（ functional cloning） - 根据特异蛋白质分离目的基因的策略 表型克隆（ ph

39、enotype cloning ） - 根据特异mRNA 分离目的基因的策略,121,氨基酸序列 核苷酸序列 PCR 特异蛋白质 目的基因 抗体 基因文库筛选 评价 优点 - 在单基因性状的基因分离方面仍为常用策略 缺点 - 特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难* - 难以分离微量表达基因 - 无法研究无蛋白质产物的基因 - 难以进行多基因控制性状的基因分离,122,通过蛋白质的抗原抗体反应分离鉴定未知基因,基因转录后在核糖体上翻译合成蛋白质，形成核糖体-mRNA-蛋白质产物部分氨基酸序列的复合体，运用抗体与蛋白质产物的免疫共沉淀反应，可以分离此复合体，进而分离到mRNA，最终克隆到未知基因。,1

40、23,西红柿女孩 一女孩患苯丙酮尿症，不食“人间烟火”，仅能吃西红柿。智力发育不全、严重的呕吐，皮肤、毛发颜色变浅，虹膜颜色减退、尿、汗有特殊腐臭。目前以低苯丙氨酸饮食治疗。,124,、定位克隆,又称为“逆向遗传学”，始于20世纪80年代后期 利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带。 定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置。 克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。,疾病,遗传标记，染色体定位,基因 序列,mRNA cDNA,蛋白质产物 生物学功能,疾病,基因,功能,125,定位克隆：通过遗传标记 ，先获得某一表型基因

41、在染色体上的定位 ，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选 ，并获得cDNA及全基因。 基本思路是通过连锁分析原理进行基因定位。 若多态标记与待定基因距离较远 ，则它们在向子代传递时会发生自由分离 ，呈“连锁平衡”；反之 ，则不发生自由分离 ，而呈现“共分离”现象 ，即“连锁不平衡”。据此可在染色体上定位与某一DNA标记相连锁的基因。,126,将基因定位于染色体 特定区段 2. 候选基因筛选鉴定,127,定位克隆的主要步骤之一是将目标基因定位于特定染色体上。 主要方法： 家系遗传调查分析法、染色体断裂点分析（家系选择、分离分析、连锁分析） 体细胞杂交法 核酸杂交技术 突变分析技术,12

42、8,家系遗传分析法,选择一个含有40多个能提供信息的减数分裂事件的三代以上 的家系，要排除家系的异质性； 除了对照基本遗传表型的各种表现型的几率外，还要考虑外显不全；以数学计算机模型模拟分析； 选择一定的遗传标记，进行基因分型，确定疾病基因在染色体上的位置。,129,基因连锁分析,连锁分析主要是应用限制酶片段长度多态性（ RFLP ）为遗传标志进行家系分析 在人类基因组中，平均约 200 bp可发生一对变异 （称为中心突变 ） 中心突变造成了序列上的多态性，不少序列多态性发生在限制酶识别位点上，产生了限制酶酶切位点的多态性 用该限制酶水解 DNA就会产生长度不同的片段，称RFLP。,130,c

43、DNA筛选 染色体定位只是定位克隆的其中一步。由于DNA筛选、确认的困难 ，是定位克隆策略的“瓶颈”。 目前获得基因序列的方法大致有: (1)对 500kb 的关键部位进行直接测序； (2)比较基因组作图和测序； (3)基因结构特征分析； (4)cDNA捕获，主要有pG岛捕捉层析法、 外显子捕捉法、直接筛选PCR法等方法,131,cDNA筛选,直接法：用基因组DNA直接从cDNA文库中筛选位于该基因组片段内的cDNA。 选择法：将基因组DNA固定在膜上，与总cDNA或cDNA文库的PCR产物杂交，找到能杂交到膜上的cDNA片段，再用PCR扩增这些cDNA片段。,132,通过EST拼接,如：已知

44、小鼠某基因在人当中有高度同源序列 用该小鼠cDNA比对人的EST数据库 得到一簇EST后，将相邻的EST通过相互重叠部分进行拼接。 得到人对应的完整cDNA的序列后，两端设计引物在cDNA文库中进行PCR，得到该cDNA的克隆。 至此，与小鼠对应的人的该基因得以克隆出来。,133,基因芯片技术的应用,使用传统方法寻找新基因，不仅需要投入大量的资金，而且针对性不强，效率低下，大部分工作繁琐重复。 通过基因芯片分析正常组织和疾病组织基因表达情况的差异，往往能够从那些表达异常的基因中发现新的致病基因。,134,附2、HGP与疾病相关基因的研究,135,随着人类基因组草图测定的完成，宣告了“ 后基因组

45、时代 ”的到来。功能基因组学成为研究的重心，蛋白质组学的研究受到了空前的关注，也为疾病相关基因的克隆创造了条件。,136,同一种细胞或组织，处于不同的状态（生理与病理等），发育的不同阶段，受到外界的不同影响时，都可能使细胞中蛋白质的情况产生相应的变化，从而产生不同的蛋白质组。蛋白质组学关注和研究的就是这些变化。,137,研究蛋白质与疾病相互关系的方法,ELISA 免疫印迹 免疫沉淀 蛋白质亲和层析 毛细管电泳,138,139,140,噬菌体展示技术,141,丝状噬菌体基因,142,143,144,建 库,145,筛选,146,147,核糖体展示 (ribosome display),核心是利用

46、体外核糖体表达载体构建 sc Fv抗体库 ,并于体外转录为 m RNA, 体外翻译表达 , 随后以固相化的抗原分子亲和筛选出核糖体 -m RNA-sc Fv复合物中的高亲和力 sc Fv。这种技术在实验中不用任何细胞 ,是第一个完全在体外筛选有功能蛋白的方法。,148,特点,不需转化细菌或真核细胞 避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失而产生的库 容下降 , 亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题。 由于核糖体展示技术的体外翻译、体外筛选的特点 , 大大缩短了实验周期 , 具有省时省力、方便快速的特点。,149,蛋白质组分离技术 双向凝胶电泳技术,双向凝胶电泳技术(2

47、DE)：又称二维电泳，其原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开。完整的双向凝胶电泳分析，包括样品制备、等电聚焦、平衡转移、SDSPAGE、斑点染色、图像捕捉和图谱分析等步骤。,150,151,双向凝胶电泳技术的应用,用于分离细胞或组织蛋白质粗提物 构建特定组织或细胞的蛋白质“二维参考图谱”； 分析特定时间与病理、生理状态下蛋白质的表达情况，进行蛋白质组差异比较。 已构建特定组织或细胞的蛋白质2DE图谱

48、数据库 不同生物、不同器官、组织、细胞的专一性2DE数据库，为实现对已知蛋白质的分析鉴定、未知蛋白的发现、总结蛋白质结构、性质与功能的规律以及实现模拟与预测等奠定了基础。,152,1.疾病的蛋白质组研究 （1）肿瘤蛋白质组研究 （2）心血管疾病蛋白质组研究 （3）神经系统疾病研究 2.病原微生物的蛋白质组研究 3.蛋白质组药物开发,153,生物信息学主要研究领域, 建立和管理各种生物信息数据库 核酸序列数据库 三维结构数据库 基因组序列信息的提取和分析 序列比对（Alignment）和结构比对 蛋白质结构预测 蛋白质编码基因的计算机辅助识别 非编码区分析和DNA语言研究 分子进化和比较基因组学 、遗传密码的起源 序列重叠群（Contigs）的装配 生物大分子结构模拟及其与疾病、药物设计 DNA芯片和微阵列的发展,154,建立和管理各种生物信息数据库,各种生物数据库的建立是一切生物信息学工作的基础。