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1、医学微生物学实验 综合性实验三,空气的细菌学检查结果分析 手指皮肤的细菌学检查结果分析,液体或固体标本菌落总数测定,可将标本作十倍、百倍、千倍、万倍稀释。 分别取1ml注入直径9cm的灭菌平皿内。 倾注46营养琼脂培养基大约15ml，混合均匀。琼脂完全凝固以后，37培养48小时。 选择菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。 将计数得到的菌落数乘以稀释倍数得出cfu/g(ml)。,手指皮肤的细菌学检查,第1格为洗手前， 第2格为洗手后， 第3格为消毒后， 第4格空白对照。,2人1块平板,上:甲、丙常规洗手 下:乙、丁标准洗手,甲（丙）,乙（丁）,丙,丁,医学微生物学实验 综合性实验一
2、,脓汁和粪便标本中病原菌的检测（三） 菌落特征观察P11 细菌纯培养P10 脓汁和粪便标本检验（录像） 油镜使用方法（讲解）,细菌在固体培养基中的生长现象,菌落定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。 菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性。 菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）。 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。,菌落特征P11 大小：大(直径约3mm以上)，中(直径约13mm)，小(直径约1mm以下)。 形状：圆形，卵圆形、假根形、丝状、不规则等。 边缘：整齐，锯齿状，波浪状，羽毛状。 表面：隆起、平坦、中
3、心凸起、脐形凹陷；光滑或粗糙、湿润或干燥。 溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落周围呈草绿色、不透明)，溶血(菌落周围出现透明环)。 色素：一般为无色或灰白色，特殊色素有两类：脂溶性色素(菌落本身着色，培养基不着色)和水溶性色素(菌落及培养基均着色)。,细菌的溶血现象,根据细菌对血平板中红细胞的溶解能力可分为以下三种溶血类型,（甲型）溶血:产生溶血素，不完全性溶血，在血平板上菌落周围有12mm半透明的草绿色溶血环。 （乙型）溶血: 呈完全性溶血，在血平板上菌落周围有24mm宽，界限分明，无色透明的溶血环。 （丙型）溶血:不产生溶血素，在血平板上的菌落周围无溶血环。,细菌的纯培养,挑选单菌落: 脓汁
4、标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落，菌落的色素是脂溶性的，是细菌本身的颜色。菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。 粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落，菌落颜色是水溶性的，不是细菌本身的颜色，颜色的产生是因为大肠埃希菌分解乳糖产酸，酸使伊红与美蓝结合，形成紫黑色具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落；菌落直径23mm。致病菌不分解乳糖，菌落呈伊红的颜色，很淡的粉红色，半透明，直径12mm。 选择平板上相同的菌落数多的、典型的、容易挑取的单菌落，进行接种。,37培养24小时,37培养24小时,紫黑色,通常描述的菌落直径和颜色是特指培养1824小时，菌
5、落分布比较稀少的区域、典型的菌落。 若培养物放置时间过长，或者平板上某个部位细菌比较多、菌落比较密集，大肠杆菌菌落颜色可能会发生改变。因为大肠杆菌利用完乳糖以后，就要利用蛋白质，蛋白质分解大多产生碱性物质，中和了乳糖分解时产生的酸。大肠杆菌菌落可能会由原来的紫黑色变成粉红色，和致病菌颜色一样。 不要在菌落密集的区域挑选菌落，它可能是菌落形成单位（CFU），不是单菌落，很容易选错。,37培养36小时,由紫黑色 变成粉红色,斜面接种法P10 （1组4支） 甲普通平板黄色菌落1支斜面 乙普通平板白色菌落1支斜面 丙伊红美蓝紫黑菌落1支斜面 丁伊红美蓝粉红菌落1支斜面 斜面标记：组号、黄色、白色、紫黑
6、、粉红。 在平皿底部玻璃上，画个大圈选菌落，同组同学认可，才能挑取。 培养时间不得超过18小时。,斜面接种法P10 甲黄色,乙白色。 丙紫黑,丁粉红。 标记：组号，颜色,安全警告,接种环接种斜面一次，可产生几十个微生物气溶胶颗粒。 气溶胶粒径100um沉降很快,50um在0.4s内扩散开,5um通过呼吸道直接到达肺泡。 Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。 实验时应坐着，在酒精灯半径20厘米范围内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。,奥林巴斯 CX21型 生物显微镜 （实验柜内，每人一台）,注意：只能横放，
7、不得竖放。,奥林巴斯 CX21型 生物显微镜,使用须知,显微镜是精密光学仪器，请不要让其受到撞击，请小心操作。 在搬运显微镜时，请按右图所示，以双手抓住镜臂孔的两侧，小心搬运。 如果拿住载物台和镜筒等部位搬运的话，有可能会造成损坏。,显微镜各部件名称,开关与调整光强,开或关之前，必须将亮度调整旋钮按箭头相反方向转动到最小位置，以免损坏灯泡。 电源开关拨到侧为开，拨到侧为关闭。 按箭头方向转动亮度调整旋钮变亮，相反方向转动则变暗。,放置标本,按箭头方向转动粗调旋钮降下载物台。 按箭头方向拉开载物台标本夹 ，自前向后将标本片放入平台，标本夹 轻轻放回原位。 转动上侧垂直移动杆和下侧水平移动杆，移动
8、标本至光路中间。,载物台位置刻度,载物台上的刻度方便确定标本位置，标本移动后可以快速回到原位。 水平刻度的标识位置以机械载物台的位置来读取。 垂直刻度的标识线以的位置来读取。,聚焦,从显微镜的侧面观察，按箭头方向转动粗调旋钮，使物镜尽可能接近标本。一边看目镜，一边慢慢逆箭头方向转动粗调旋钮， 使载物台下降。 看到标本以后，用微调旋钮来正确对焦。10倍物镜的工作距离（WD，从物镜到标本的 距离）为10.5mm。 油镜的WD为0.13mm。,调整瞳距,调整瞳距是调整双目间的距离，使两眼同时看到一个显微镜像，能防止观察时的疲劳。 方法：一边看目镜，一边移动双目镜筒，让左右的视野一致。 标识的位置表示
9、瞳距。请记住自己的瞳距值，以便下次观察时调整。,调整屈光度数,调整观察者左右视力。 以右眼看右侧的目镜，旋转粗微调旋转盘，对好焦距。 以左眼看左侧的目镜，旋转屈光度调整环，对好焦距。,调整聚光镜位置和孔径光阑,用聚光镜上下移动旋钮，将聚光镜转到最上面。 在孔径光阑环上刻有物镜倍率（10倍，100倍等），观察时将与使用物镜相对应的倍率放到正面。,转换物镜,旋转物镜转盘，将希望使用的物镜（10倍、100倍）转到标本的上方。,100倍浸油物镜使用方法,油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。 旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。 如果浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物
10、镜转盘，使油镜来回通过12次浸油，排除油内气泡。,显微镜油镜的使用P13,10物镜标本位置滴加香柏油100油镜浸泡油中,几乎与标本接触（工作距离0.13mm）细调节调焦，观察物像记录结果关闭电源。 油镜处理：擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。 显微镜罩上防尘罩 横放在实验柜内。 (顺德校区）实验台两侧的电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近的电源插座。 （校本部）实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧的插座。,细菌的显微镜检查法,显微镜：光学显微镜 目镜：10倍 物镜：油镜头（90或100倍） 放大倍数：1090或100
11、900或1000 镜油：香柏油或石蜡油 香柏油折射率（n1.515），玻片折射率（n1.52），石蜡油（n1.46），空气（n1.00）。 油镜使用完毕必须擦拭油镜头。,油,透镜,光线,载玻片,思考题,在微生物学实验中,怎样才能避免杂菌的污染? 空气的卫生标准规定如何? 你的实验结果说明了什么问题? 怎样从医务人员手指上分离和鉴定金黄色葡萄球菌? 菌落特征主要描述哪几方面问题？任何挑选单菌落？,医学微生物学实验 综合性实验三、一,空气、手指皮肤的细菌学检查结果分析 脓汁和粪便标本中病原菌的检测 菌落特征观察P11 细菌纯培养P10（纯培养不得超过18小时） 油镜使用方法（讲解） 脓汁标本检验 （录像） 肠道致病菌的分离鉴定（录像）,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。 试管架上器材：按接种针、接种环、油性笔和打火机的顺序，分别放置在试管架中间两行，靠近电源插座一侧。 器材使用以后，必须放回原处，依次摆整齐。,实验室器材 整齐有序,