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1、Western blot,焦丰龙,Western Blot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。,实验过程,SDS-PAGE的配置 转膜 封闭及抗体的孵育 蛋白监测,SDS-PAGE的配置,（1）10%分离胶（7.5mL）：准备好电泳装置，按照下表浓度一次加入到小烧杯中，使其充分混合，迅速将其加入到制胶器中，添加到离口2到3厘米处，在上层覆盖一层水，防止氧化，静置30min,待胶凝固。 分离胶的配置
2、 H2O 1.7mL 30% acrylamide mix 3.25mL 1.5 M Tris(pH 8.8) 1.9mL 10% SDS 0.075mL 10% ammonium persulfate 0.075mL TEMED 0.03mL,SDS-PAGE的配置,（2）浓缩胶（3mL）:去除分离胶上面的水，多余水分可使用滤纸吸干。按下面的浓度依次加入到烧杯中，使其充分混合，迅速加至聚合好的分离胶上，处理气泡，插入梳子。 浓缩胶的配置 H2O 2.1mL 30% acrylamide mix 0.5mL 1.0 M Tris(pH 6.8) 0.38mL 10% SDS 0.03mL 10
3、% ammonium persulfate 0.03mL TEMED 0.003mL,SDS-PAGE的配置,待浓缩胶完全聚合后，拨出梳子，用超纯水洗净加样槽，除去未聚合的丙烯酰胺和其他杂质。将凝胶固定在电泳装置上，在上下槽中加入电泳缓冲液。 电泳：Stacking gel , 95V , 25min ; Resolving gel , 130V , 1.5h,转膜,准备好转膜装置，将SDS-PAGE胶用转膜液洗2次，每次洗15min； 预先将NC膜，Whatman paper和海绵垫放在转膜缓冲液中5-10min； 转膜：装模装置从下至上依次按阴极板、垫片、海绵垫、Whatman paper
4、、凝胶、NC膜、Whatman paper、海绵垫、垫片、阳极板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，接通电源，4摄氏度，横流18V，500mA,4.5h; 将膜取出，在1TBS-T清洗，215min； 用Ponceau染色15min, 1TBS-T清洗，315min；,封闭及抗体的孵育,4mL Blocking buffer 室温封闭1 h； 在Blocking buffer 中加入相应稀释倍数的一抗，4摄氏度孵育过夜， 1TBS-T清洗， 315min； Blocking buffer室温封闭1 h； 在Blocking buffer （5%TBST+牛奶）中加入相应稀释
5、倍数(500010000)的已经偶联HRP的二抗，室温孵育1h， 1TBS-T清洗， 315min；,蛋白检测,使用Amersham的ECL Plus或ECL Advance试剂盒监测，将含有蛋白面朝上，将SolutionA和Solution B充分混合后加到膜上，室温孵育5min； 用保鲜膜包好膜，放在X光片暗匣里面，在暗房中取出X光片，暴光30秒-1分钟，显影30秒，定影,移液器的使用,设定移液体积 大量程调节至小量程时，正常调节，逆时针旋转刻度就可以，小量程调至大量程时，应先调至超过设定体积刻度，一半多转1/3圈到半圈，再回调至设定体积，这样可以保证移液器的精确度 吸液 吸液前枪头先在液体中预润洗,