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1、实验二、双向琼脂扩散试验,实验目的：,了解双向琼脂扩散的原理和用途。 掌握抗体效价的测定方法。 观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。,可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他来源的蛋白质、多糖质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后，在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称为沉淀反应。 沉淀反应中的抗原叫沉淀原（precipitinogen）,与沉淀原发生反应的抗体称为沉淀素（precipitin）。 沉淀反应主要包括有环状沉淀反应、絮状沉淀反应和琼脂扩散反应。,实验原理,将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散， 当
2、抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。,双向琼脂扩散试验,一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带 根据沉淀带出现的数目、位置以及相邻二条沉淀带之间的融合、交叉、分枝等情况，就可了解该复合抗原的组成。,免疫学及免疫学检验,A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B ： Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ； C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；D： 扩散率近似，浓度Ag Ab ；E：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab ；F：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab,沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系,免疫学及免疫学检验,(1) 沉淀线吻
3、合：待检抗原与标准抗原完全相同。 (2) 沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。 (3) 沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。 (4) 沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。,A1：待检抗原；A2：标准抗原,抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原， 周围孔放下不同稀释度的 相应抗体，以出现沉淀线 的最高稀释倍数为该抗体 的效价。,免疫学及免疫学检验,材料与试剂 1琼脂粉 2平皿 3打孔器 4生理盐水或其他缓冲液 5. 抗原、抗体,操作方法 1称取一定量的琼脂粉，按1.5%的比例加入生理 盐水或缓冲液，煮沸融化。
4、2将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm3mm。自然冷却。 3根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径35mm）打成梅花形孔图。,4挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。 5在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。 6吸取样品加入孔内(约15ul)，以加满为度。 7加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿 盘中，37自由扩散24h48h。,结果判定 用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。,2,1,3,4,5,6,双向免疫扩散凝胶染色图,1.双扩散用于疾病诊断： 以IBD诊断为例，中心孔加IBD标准阳性血清，周围孔分别加IBD标准抗原、生理盐水、待检抗原1.2.3.4。 2.双扩散用于抗体检测： 以免疫鸡IBD抗体检测为例，中心孔加IBD标准抗原，周围孔分别加IBD标准阳性血清.、 IBD阴性血清、待检血清 1.2.3.4。,