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1、医学资料,1,生化技术 Biochemical Technique 上海第二医科大学检验系 临床生化与生化技术检验,医学资料,2,一.什么是生化技术？ 生化技术是研究生物体的化学组成 、结构、功能以及在生命活动中化学物 质的代谢、调节控制等的实验方法。,医学资料,3,内容： 生物大分子的一般制备 分子生物学的基本操作,医学资料,4,分离纯化检测生物大分子 电泳 Electrophoresis 层析 Chromatography 离心 Centrifugation 检测 光谱分析法,分离,医学资料,5,二.生物大分子的一般制备法 体液： 直接分离生物样品 组织细胞：先破细胞分离 检测,医学资料,
2、6,生物大分子制备的四个阶段,选择材料和预处理 组织细胞的破碎及细胞器的分离 生物大分子的分离纯化 浓缩、干燥和保存,医学资料,7,（一）材料选择和预处理： 微生物 植物 动物,医学资料,8,（二）组织细胞破碎的方法： 1.物理方法： 玻璃匀浆器(homogenizer),医学资料,9,研钵（加净砂或玻璃粉）,医学资料,10,高速组织捣碎器,医学资料,11,超声波,医学资料,12,渗透压法 反复冻融法,医学资料,13,2.化学方法 有机溶剂（破坏细胞膜的脂质 双分子层） 3.酶法 自溶法（蛋白酶、酯酶） 酶解法（溶菌酶破坏细胞壁的 -1，4-糖苷键）,医学资料,14,（三）生物大分子的分离、纯
3、化 以蛋白质为例 【提取】相似相溶 1.水溶液的提取 中性盐溶液提取： 缓冲液提取： 2.有机溶剂提取,医学资料,15,【分离纯化】 1.根据蛋白质溶解度不同的分离方法： （1）盐溶与盐析 （Salting in & Salting out) 蛋白质、酶及其它们与其它物质的复合体在离子强度低的盐溶液中，其溶解度随着盐溶液浓度的升高而增加，此现象称为“盐溶”。,医学资料,16,当溶液中盐浓度不断上升，达到一定程度，蛋白质等的溶解度反而逐渐减小，并先后从溶液中析出，称为“盐析”。,医学资料,17,盐析作用的产生 由于盐离子同水分子发生水合作用， 造成盐离子与蛋白质分子争夺水分子， 减弱了蛋白质的水
4、合程度。 蛋白质表面的电荷被盐溶液中对应的 离子中和，其水化膜层被破坏，使蛋 白质等的溶解度下降，蛋白分子相互 聚集而沉淀析出。,医学资料,18,中性盐的选择 硫酸铵 (NH4)2SO4 硫酸钠 Na2SO4,医学资料,19,例：分离球蛋白和白蛋白 血清1ml 1ml PBS充分混合。 逐渐加入饱和(NH4)2SO4 溶液至50%，边加边搅拌。 离心 上清 沉淀（球蛋白）,医学资料,20,（2）等电点沉淀法（溶解度最小） PI MW Alb 4.86 66 000 1 5.02 130 000 2 5.02 200 000 5.12 1 300 000 6.87.3 1 500 000,医学资
5、料,21,（3）低温有机溶剂沉淀法 甲醇、乙醇、丙酮使多数蛋白质溶解度降低 并析出。 脱水、介电常数小 分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在 低温下进行。 （4）聚乙二醇沉淀法,医学资料,22,2.根据蛋白质分子大小不同的 分离方法：,医学资料,23,（1）透析和超滤 （Dialysis & Ultrafiltration) 透析： 利用溶液组分能否通过半透膜并由引起膜两边溶液的化学势能不同，而达到去除溶液中的小分子物质。 超滤（反向渗透） 利用压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质不能透过半透膜仍留在膜上。,医学资料,24,（2）凝胶层析法（Gel Chromatogr
6、aphy) 利用各种物质分子大小不同，在固定相上受到阻滞程度不同而达到分离的一种层析方法。 （3）SDS-PAGE,医学资料,25,3.根据蛋白质带电性质差异的分离方法： 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 离子交换层析法,医学资料,26,醋酸纤维素薄膜电泳 血清蛋白质的分离 分子量 pI 白蛋白 66000 4.86 1球蛋白 130000 5.02 2球蛋白 200000 5.02 球蛋白 1300000 5.12 球蛋白 1500000 6.8-7.3,医学资料,27,+,白蛋白,1,2,加样,医学资料,28,+,医学资料,29,清蛋白Alb,2
7、,1,+,医学资料,30,医学资料,31,琼脂糖凝胶电泳,从海藻中提取出来的一种线状高聚物，由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成三维空间结构。,医学资料,32,分离血浆脂蛋白 脂质 蛋白质 直径 CM 98% 2% 100 VLDL 90% 10% 75 LDL 70% 30% 20 HDL 50% 50% 10,医学资料,33,加样槽 前 ,CM LDL VLDL HDL,+,医学资料,34,+,医学资料,35,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（1）丙烯酰胺结构式,医学资料,36,（2）亚甲双丙烯酰胺,医学资料,37,医学资料,38,等电聚焦电泳,载体两性电解质,医学资料,39,医学资料,40,离
8、子交换层析法,医学资料,41,医学资料,42,4.根据配体特异性的分离法： 亲和层析,医学资料,43,5.根据被分离分子的密度 -离心技术,医学资料,44,【鉴定】 检测-光谱分析法 RNA & DNA 260nm 蛋白质 280nm,医学资料,45,（四）浓缩、干燥、保存 样品的浓缩 1、减压加温蒸发浓缩 2、空气流动蒸发浓缩 3、冰冻法 4、吸收法 5、超滤,医学资料,46,干燥 真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存。 冷冻干燥在相同压力下，水蒸汽压力随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。,医学资料,47,保存 1、干燥制品的贮存 2、液态贮存 样品不能太稀 一般
9、需加入防腐剂、稳定剂 低温贮存,医学资料,48,三、 分子生物学技术,重组DNA技术的基本步骤 1.目的基因的获得 2.目的基因与载体的连接 3.重组DNA分子导入受体细胞 4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆 5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离,DNA的提取：组织、细胞、质粒 RNA的提取：组织、细胞 PCR技术：常规PCR、RT-PCR 限制性内切酶 Western blot,医学资料,49,四.生化技术的特点： 1.条件温和 2.实验条件与机体内环境尽 量符合,医学资料,50,五.生化技术的应用： 1.工业、农业研究、生产 2.生化研究 3.临床应用、诊断,医学资料,51,六.发展趋势： 超微量 高效 自动化 快速 综合联用 比色- 计算机,医学资料,52,小结： 1、掌握生物大分子的制备分离纯化的方法； 2、熟悉生化技术的定义和特点； 3、了解生化技术的应用发展趋势。,医学资料,53,思考题： 1、常用组织细胞破碎的方法有哪些？ 2、请列举生物大分子分离纯化的方法，并分别简述其原理。,医学资料,54,参考书目： 赵永芳主编生物化学技术原理及其应用第二版；第三版,