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1、第十一章 种质离体保存,11.2 常低温和低温保存,11.1 种质常温保存,11.3 超低温保存,主要内容,具有世界先进水 平的国家种质资 源库,国家种质资源库内景一角,国家 种质 资源 库内 景,国家种质库是全国作物种质资源长期保存与研究中心。该库在美国洛克菲勒基金会和国际植物遗传资源委员会的部分资助下，于1986年10月在中国农业科学院落成，隶属于作物品种资源研究所。 由试验区、种子入库前处理操作区、保存区三部分组成 。种质贮藏条件为：温度-181，相对湿度50%。,国家种质库保存对象是农作物及其近缘野生植物种质资源，这些资源是以种子作为种质的载体，其种子可耐低温和耐干燥脱水。国家种质库在
2、接纳到种子后，需对种子进行清选、生活力检测、干燥脱水等入库保存前处理，然后密封包装存入冷库。入库保存种子的初始发芽率一般要求高于90%，种子含水量干燥脱水至5%7%，大豆8%。根据科学家估算，在上述贮藏条件下，一般作物种子寿命可保存50年以上。,国家种质库的任务： 负责全国农业植物种质资源的长期保存，以及部分粮食作物种质资源的中期保存。 进行低温库种质安全保存基础理论的研究，发展库存种质安全保存的预警、监测及更新等技术。 研究无性繁殖作物、顽拗型种子作物等特殊种质的中长期离体保存理论和技术，探索和发展种质资源新的保存方法与技术。,保存对象：凡能通过种子繁殖维持物种遗传完整性的各类植物种质资源，
3、都可保存到国家种质库，其种子应是耐低温和耐干燥类型，即正常型种子（orthodox seeds）。,入国家种质库保存种质的基本要求 提供每份种质材料的背景信息资料，如品种名称、学名（科、属、种的拉丁文）、原产地、繁育条件及种植时间； 每份送交材料须提供一定数量的种子，一般3000至5000粒特殊情况可适当减少，但不应少于1500粒； 应是当季新种植收获的种子，发芽率一般要求85%以上。种子无明显病虫损害，未受损伤和拌用药物或包衣处理；,送交时包装的要求：送交或邮寄种子要妥善包装， 每份材料包装袋内和袋外都应有标签，标明品种名 称、统一编号保存单位编号。包装要结实牢固、防 漏、防潮、防混杂、防散
4、包，以避免种子在送交或邮 寄途中受损； 送交种子要清选干净，去除破碎粒、虫蚀粒、无胚 粒、秕粒、瘦小粒、杂粒等，杂质不得超过2%； 送交时种子含水量的要求：禾谷类不得超过13%； 蛋白质类与油脂类种子含水量应更低一些。 有其他情况可与国家种质库预先联系。,江苏镇江桑树圃,呼和浩特牧草圃,浙江杭州茶树圃,国 家 种 质 圃 （包括试管苗库）,种质是指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。 植物种质保存是利用天然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有的遗传物质保持遗传完整性，有高的活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。 种质保存方式：原地保存和异地保存。 前者通过建立自然保护区和天然公园里实
5、现，后者通过植物园、种质园、种子库及离体保存来实现。,离体保存：将组织和细胞培养中的外植体或试管苗贮存在使其抑制生长，缓慢生长或无生长的条件下，达到长期保存的方法。 离体保存的优点： 1、解决一些无性繁殖作物种质资源在低温下长期保存问题，可有效避免资源的丢失。 2、节省土地和劳动力，保存方法简单，花费少，且能在保存中脱毒。 3、在提供利用时，可快速繁殖，也有利于国际国内种质交换。,一 、 常温保存,在常温（205）下，通过改变培养基中某些培养物质的浓度，改变培养的环境条件，可达到保存目的。 方法： 改变培养基无机盐的浓度，主要降低。 培养基里添加甘露醇，蔗糖等物质。 培养基中添加植物生长调节剂
6、 降低培养环境的氧含量 步骤：在保存材料上覆盖一层矿物油如石蜡、硅酮 油或液态石油。降低培养环境的氧分压。,二 、常低温和低温保存 常低温（15-0 ）和低温（0- -50 ）保存，还可辅以改变培养基成分和培养条件，以减缓材料的生长速度减缓继代时间，故又称为最小生长法。 根据植物对温度的耐受力确定其抑制生长的保存温度。在低 温保存时还可以结合低压来取得更好的效果主要通过降低培养物周围的大气压，也可以通过在正常的气压下加入惰性气体而降低氧分压。低气压和低氧压都可抑制植物的生长，但不会导致培养物表现型上的差异。,三 、超低温保存 也叫冷冻保存。主要是指在液氮（-196 ）的超低温下使细胞代谢和生长
7、处于基本停止的状态，在适宜的条件下可迅速繁殖，生出新的植株，并保持原来的遗传特性。,（1）冰冻保护剂,渗透型抗冻剂：二甲亚砜（DMSO）、乙二醇、乙酰胺、丙二醇、甘油。 特点：多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的的粘性增加而减少水的结晶过程，达到保护的目的。 非渗透型抗冻剂：聚乙烯吡咯烷酮（pvp）、蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇等为非渗透型抗冻剂 特点：可溶于水，但不能进入细胞，可在特定的温度下降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护作用。,（2）保存液 组成部分：电解质平衡盐溶液 高渗溶液：选用葡萄糖、甘露醇、蔗糖等作为高渗剂。 营养液：氨基酸、核甘类、葡萄糖。,（3）材料
8、的预备和预处理,材料的生长状态和年龄的选择 培养细胞处于旺盛的对数分裂期 液体悬浮培养细胞以57天 抗冻能力强， 固体培养的愈伤组织以912天为宜 存活率高野外生长的植物的芽（冬天低温锻炼）,预培养：在冰冻保存前的预培养中加入提高抗寒力的物质如：梨糖醇、脱落酸等，或将培养基的糖浓度提高，这样可以提高存活率。 冰冻保护剂：由于一些冰冻保护剂的成分有毒性，冰冻保护剂预处理必须在0 下进行处理时间不能太长，一般不超过1h。,（4）超低温保存操作, 快速冷冻法 慢速冷冻法 分步冷冻法 脱水干燥法 化冻操作 再培养 生活力和存活力的测定 荧光素双醋酸酯染色法FAD 氯化三苯四氮唑法 TTC,快速冷冻法：
9、适用于培养物细胞体能小，胞质浓、含水量低、液泡化程度低的材料。将植物材料从0或其他预处理温度直接投入液氮罐中，降温速度为1000/min以上。这种快速降温可使细胞内的水在迅速越过-140这一冰晶形成的危险温度期后，细胞内的水形成“玻璃化”状态，不会对细胞产生破坏作用。,慢速冷冻法：适用于含有大液泡的成熟细胞，这种细胞含水量高，在慢速降温过程中，可以使细胞内的水有充足的时间不断地渗到细胞外结冰而避免在细胞内结冰。 将植物材料以0.110/min的降温速度从0降到-100左右，而后立即浸入液氮罐中或以同样的速度连续降温至-196。,1、先慢速降温，以0.54 /min的速度将材料慢速降温至-40
10、，停留一段时间后，是材料充分脱水，然后投入液氮迅速冷冻。 2、把材料在0 预处理后，逐级通过不同的低温温度一段时间，然后投入液氮管。,脱水干燥法：将培养材料的含水量降到一定程度，在进入液氮罐中，这样可使植物免遭冻死。 无菌气流中干燥、硅胶干燥、2129烘箱内真空干燥法等方法将含水量降到27-40%。 玻璃化法：用高浓度的复合玻璃化保护剂使样品脱水减轻机械损伤和溶液效应，应用价值高。 包埋脱水法：将样品用高浓度的蔗糖进行预处理，包埋到海藻酸胶中，避免了二甲亚砜和甘油的毒性。,化冻操作 快速化冻：在3540温水中化冻 慢速化冻：在0，23或室温下进行化冻 注意事项： 1、操作轻，避免组织和细胞的机
11、械损伤 2、将冰冻样品试管插入温水浴中时，注意避免管口污染； 3、试管内的冰一旦化冻后，要立即将试管移到20-25的水浴中，并立即迅速进行洗涤和再培养。,再培养：化冻后立即将材料转移到新鲜培养基上进行再培养。在这过程中可以观测细胞的增生数量，愈伤组织的形成和增长情况，大小和数量的变化，新植株分化的能力等。 荧光素双醋酸酯（FAD）染色法：先配制0.1%的荧光素材料，用一滴染料和一滴化冻后的细胞悬浮液相混合，分别置于普通光学显微镜（观察总细胞数）和紫外荧光显微镜（观察活细胞数）下观察和计数。 TTC法（氯化三苯四氮唑）：此法显示细胞内脱氢酶的活性，脱氢酶使TTC还原生成一种红色的物质，作为检验活细胞的方法 。,本章要点 1、理解种质的常温保存方法。 2、理解种质的常低温和低温保存方法。 3、掌握种质的超低温保存程序。,作业题 1、传统的植物种植资源保存方式什么？有何局限性？ 2、低温保存与超低温保存有何异同？ 3、在超低温保存中，采用哪些措施以尽量避免植物材料的伤害？,