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1、,实验四：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,1.掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义; 2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质的操作技术; 3.熟悉电泳仪器的使用和操作。,一、实验目的：,二、实验原 理：,（一）电泳(electrophoresis) ：带电粒子在电场中向与其电性相反的电极方向泳动的现象。,电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。,（二）电泳法：利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的方法和技术。,醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。 血清中
2、各种蛋白质的等电点在pH4.07.3之间，在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快；反之，则较慢。,（三）血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳原理,定量-将染色后的区带分别剪开，将其溶与碱液，进行比色测定，计算各区带的百分数。,醋酸纤维素薄膜 具有均一的泡沫状结构（厚约120m），渗透性强，对分子移动的阻力很弱。 用其作支持物进行电泳，具有微量、快速、简便、分离清晰、对样品无吸附现象等优点。 现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离
3、和免疫电泳等方面。,三、实验器材,1. 电泳仪：为电泳提供直流电源。 2. 电泳槽：为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用铂丝。 3. 血清加样器 ：可用盖玻片或X胶片或微量加样器。 4. 醋酸纤维素薄膜：2cm8cm 5. 其它： 培养皿（直径9-10cm）、滤纸、玻璃板、镊子等。,DYY-5型稳压 稳流电泳仪,DYY-型 电泳槽,四、实验试剂和材料,1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH=8.6，离子强度 0.075)：称取1.66g巴比妥和12.76g巴比妥钠,置于大烧杯中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定溶至1000ml。置4保存，备用。 2、染色液：称取0.5g氨基黑，
4、甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水加至100ml。 3、漂洗液：取无水乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml，混匀置塞试剂瓶内贮存。 3、0.4N氢氧化钠：称取氢氧化钠16.0g，蒸馏水加至1000ml,1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中10-30分钟后，每组取醋酸纤维素薄膜1张，取时用竹镊子夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸中，并用它吸干表面液体。,五、实验操作步骤,（一）仪器与薄膜的准备,2. 电泳槽的准备,点样时，先在醋酸纤维薄膜的无光泽面距一端1.5cm处，预先用铅笔划一条线作为点样线，在缓冲液中浸泡10分钟后，用滤纸吸去多余的缓冲液，用点样器的边缘沾上
5、血清后，在点样线上迅速地压一下，使血清通过点样器印吸在薄膜上，点样力求均匀。（见图）。此步是实验的关键。,醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）,（二）点样：,将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上(见下图)。 要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。 连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电压为100伏，电泳时间1hr。电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源。,醋酸纤维薄膜电泳装置示意图 1. 滤纸桥 2. 电泳槽 3. 醋酸纤维素薄膜 4. 电泳槽膜支架 5. 电极室中央隔板,（三）电 泳,电泳完毕后将薄膜取下,
6、 直接浸于氨基黑10B的染色液中，染5 min取出。将薄膜从染色液中取出后用水冲洗后，依次在第一、第二、第三漂洗液中漂洗，最后再用清水漂洗一遍，直至可清晰分辨出5条色带。取出薄膜放在滤纸上。,血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意图,（四）染色与漂洗,漂洗完毕后将薄膜取出, 放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在预习本上，并判断分析其结果。,（五）记录和分析实验结果,六、注意事项,1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去， 吸水量以不干不湿为宜。 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏 膜片或印
7、出凹陷影响电泳区带分离效果。 4、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过 多或过少。 5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且 点样面向下。 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间 太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要 时可进行复染。,附：,临床意义,血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分,含量为6080g/L ,绝大部分由肝脏合成,仅球蛋白由浆细胞合成正常值: 白蛋白57%72% 1球蛋白2%5% 2球蛋白4%9% 球蛋白6.5%12% 球蛋白12%20% 血浆蛋白的主要功能: 维持血浆胶体渗透压 调节血浆pH值,维持酸碱平衡 运输营养物质,代谢物,激素,药物及金属离子等 免疫作用,肝炎:白蛋白,a1-球蛋白,a2-球蛋白,-球蛋白下降,-球蛋白升高 肝硬化:白蛋白,a1-球蛋白,a2-球蛋白下降明显, -球蛋白极度升高 肾病综合症:白蛋白降低,2和球蛋白升高,临床意义: 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾等疾病参考。,