北工大微生物学第2章.ppt

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1、第二章 微生 物的 纯培 养和 显微 技术,培养物:在人为规定条件下培养,繁殖得到的微生物群体. 纯培养物-而具有一种微生物的培养物. 显微技术-显微标本的制作,观察,测定,分析及记录等.,自然环境如土壤和水中，通常栖息着的是许多不同微生物混杂在一起的群体。哪怕是一粒砂或尘土，也常含有多种细菌及其它微生物。,第一节 微生物的分离和纯培养,一. 无菌技术 培养物的纯洁 污染 自身/环境 1.微生物培养常用的器具及其灭菌 试管 玻璃烧瓶 培养皿 培养基,第一节 微生物的分离和纯培养,2.接种操作,二、用固体培养基获得纯培养,微生物在自然界中不仅分布很广，而且都是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一

2、微生物，必须把混杂的微生物类群分离开来，以得到只含一种微生物的培养。微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。纯培养的分离，是研究和利用微生物的第一步，是微生物工作中最重要的环节之一。 最常用的方法有涂布平板法、稀释倒平板法、平板划线法、 稀释摇管法等分离法等。,二、用固体培养基获得纯培养,涂布平板法-将已经熔化的培养基倒入无菌培养皿,制成无菌平板,冷却凝固后,将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面,再用无菌涂布棒将菌液均匀的分散至整个平板表面,经培养后挑取单个菌落.,涂布平板法:,平板涂布分离法（Spread Plate）,简单易行，但易造成机械损伤,L

3、iquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.,纯培养的分离方法,稀释倒平板法,稀释倒平板法,这是最常用的纯种分离法，先将待分离的材料作一系列的稀释(如1：10、1：100、1：1000、1：10，000)，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至45的琼脂培养基相混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，平皿上就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到

4、纯培养。,稀释倒平板法分离微生物,平板划线法,将已熔化的培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，用接种环沾取少许待分离的材料，在培养基表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物将随着划线次数的增加而分散，经保温培养形成菌落。划线开始的部分细菌分散度小，形成的菌落往往连在一起。由于连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落。这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来，故可获得纯培养。用其他工具如弯形玻璃代替接种环，在培养基表面涂布，亦可得到同样结果。此法较为简便。,平板划线法分离微生物,平板划线分离法（Streak Plate）,特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品）

5、连续划线（适用于浓度较小的样品）,An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar.,稀释摇管法,先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热,使琼脂熔化后冷却并保持在500C左右,将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释,试管迅速摇动均匀,冷凝后,在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡混合物,将培养基和空气隔开.培养后,菌落形成在琼脂柱的中间.进行单菌落的挑取和移植,需要先用一灭菌针将液体石蜡-固体石蜡盖取出,再用一只毛吸管插入琼脂和管壁之间,吹入无菌无氧气体,将琼脂柱吸出,置放在培养皿中,用无菌

6、刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植.,微生物纯培养分离方法的比较 涂布平板法:简单易行，但易造成机械损伤 稀释平板法 既可定性，又可定量，用途广泛 平板划线法 方法简便，多用于分离细菌 稀释摇管法局限于高度专业化的科学研究,Viable cell count,1.dilute sample,1 ml,9 ml,10 100 1000 104 105 106 107,cell no/ml,2. plate out 0.1 ml,Inoculating an agar plate to obtain single colonies,Mixed culture,Pure culture,Mixe

7、d culture,Oral swab,Swab from sole of shoe,Each colony was examined microscopically,三、用液体培养基获得纯培养,个体大的细菌 原生动物 藻类 稀释法-接种物在液体培养基中进行顺序稀释,以得到高度稀释效果,使一只试管中分配不到一个微生物.如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物.如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了,得到的纯培养物的概率就会下降.,液体稀释法,四. 单细胞挑取法分离,这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。具体方法是

8、将显微镜挑取器装置在显微镜上，把一滴菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个单独的细胞挑取，再接种到培养基上培养。此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。,单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,五. 利用选择培养基分离法,不同微

9、生物需要不同的营养物质。有些微生物生长适于酸性环境，有些则适于碱性环境。各种微生物对不同的化学试剂如消毒剂(酚)、染料(结晶紫等)、抗生素及其他物质等具有不同的抵抗能力。利用这些特性，便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择性培养基，以达到纯种分离的目的。另外，也可以将待分离的样品先进行适当处理，以消除不希望分离到的微生物。对一些生理类型比较特殊的微生物，为了提高分离机率，往往在涂布分离前先进行富集培养，其目的是提供一个特别设计的培养环境，以帮助所需的特殊生理类型的微生物的生长，而不利于其他类型微生物的生长。,选择性培养分离法,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以

10、根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,利用选择培养基进行直接分离 富集培养,选择培养基分离法,1.dilute sample,1 ml,9 ml,10 100 1000 104 105 106 107,细菌在固体培养基中的生长情况,细菌在液体培养基中的生长情况,细菌在半固体培养基中的生长情况,六. 微生物的保藏技术,通过分离纯化得到的微生物纯培养物,必须通过保藏技术使其在一定时间内不死亡,不会被其他微生物污染,不会因发生变异而丢失重要的生物学性状,否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行. 生物的生长一般都需要一定的水分,适宜的温度和合适的营养,

11、微生物也不例外.菌种保藏就是根据菌种的特性及保藏目的的不同,给微生物菌株以特定的条件,使其存活而得以延续. 例如:培养基或宿主菌株连续移种 改变环境条件-干燥,低温.缺氧.避光,缺乏营养 使菌株的代谢水平降低,乃至完全停止.半休眠. 休眠.,六. 微生物的保藏技术,菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。,菌种保藏的目的,菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持 其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死 亡、不变异、不被污染，以达到便于研 究、交换和使用等诸方面的需要。,菌种保藏的原理,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。,其次应

12、人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。,尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株,菌种保藏方法,各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。,斜面低温保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法,1. 斜面低温保藏法常用保藏法,将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）

13、再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏， 如此连续不断。,此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏 此法的主要保藏措施是低温。一般可保存16 个月左右。 优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点 是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期 短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污 染。,2. 石蜡油封藏法,此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体 石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物） 上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝， 加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4冰箱内 保藏。,此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。 此法

14、的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保 存12年左右。,3. 砂土管保藏法,一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的 微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的 细菌及酵母则不适用。,砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等 诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物 移接方便，经济简便。它的保藏期约110年。,该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121蒸汽灭菌11.5h，间歇灭菌3次。50烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约24h，用火焰熔封管口

15、(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4冰箱内保藏。,4. 麸皮保藏法,又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然 后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水 以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经 冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将 试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干 燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔 封，再保藏，则效果更好。,此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏 期在1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较 多采用。,5. 甘油悬液保藏法,此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。

16、保藏温度若采用20，保藏期约为0.51年，而采用70，保藏期可达10年。,将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在1015，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。 基因工程菌常采用本法保藏。,6. 冷冻真空干燥保藏法,又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。,此法适用于各大类微生物。 此法的主要保藏措施是低温、

17、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达515年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。 该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。,7. 液氮超低温保藏法,简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（196）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。,此法适用于各种微生物菌种的保藏。 此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。 此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种

18、培养形式的微生物进行保藏。 其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。,8. 宿主保藏法,此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。,植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。 噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。 动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。,在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保 藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简 便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬 液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和 液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效 果最好。应用时，可根据实际需要选用。,美国采用冷冻干燥保藏

19、法和 液氮保藏法来保藏所有菌种。,我国采用斜面低温保藏法、 冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进 行菌种保藏。,第二节 显微镜和显微技术,微生物-显微镜观察 显微镜观察的因素-1.分辨率:能辨别两点之间最小距离的能力; 2.反差:指样品区别于背景的程度,他们与显微镜的自身特点有关,但也决定于进行显微镜观察时对显微镜的正确使用以及良好的标本制作和观察技术.这就是显微技术. 现代显微技术-不仅是观察物体的形态.结构,而且发展到对物体的组成成分定性和定量,特别是与计算机科学技术的结合出现的图象分析.模拟仿真等技术,为探索微生物的奥秘增添了强大的武器.,第二节 显微镜和显微技术,一. 显微镜的种类和原理 显微

20、镜-将微小物体或物体的微细部分高倍放大，以便观察的仪器或设备。 1. 普通光学显微镜 以可见光为光源的显微镜。普通的光学显微镜在结构上可分为光学系统和机械装置两个部分。光学系统主要包括目镜、物镜、聚光器、光阑及光源等部分。机械装置主要包括镜筒、镜柱、载物台、镜座、粗细调节螺旋等部分,第二节 显微镜和显微技术,目镜位于显微镜筒的上方，一般由两个凸透镜构成。它除了进一步扩大 物镜所形成的实像之外， 也限制了眼睛所观察的 视野。按放大率分, 常用目镜有5倍、 10倍和15倍三种。,第二节 显微镜和显微技术,物镜一般位于显微镜筒的下方，接近所观察的物体。由810片透镜组成。其作用一是放大(给物体造成一

21、个放大的实像）,二是保证像的质量,三是提高分辨率。常用物镜可按放大率分为低倍 (4)、中倍(10或20)、高倍 (40)和油浸物镜(100)。多个物镜共同镶在换镜转盘上，可以按需要转动转盘选择不同倍数的物镜。,第二节 显微镜和显微技术,显微镜的放大倍数为目镜倍数乘物镜倍数，如目镜为10倍，物镜为40倍,则放大倍数为4010倍（放大400倍）。优良的显微镜可放大2000倍，可分辨相距110cm的两点。 普通光学显微镜的照明光源位于聚光器的下方，为特制的照度均匀的强光灯泡，并且配有可变电阻，可以改变光线的强度。,第二节 显微镜和显微技术,由于普通光学显微镜的光源光线自镜体下方向上透射，通过聚光镜、

22、物镜，达到目镜，因此在医学及生物学研究中必须将被观察的样品切成能透过光线的、厚约6mm 的薄片，并且要进行染色以显示不同的组织和细胞等细微结构。,第二节 显微镜和显微技术,整个加工过程称常规组织制片技术，包括选取适当的组织材料经甲醛（福尔马林）液固定，逐级酒精脱水，石蜡包埋，用切片机将组织切成薄片裱在玻璃片上，再经苏木素伊红染料着色，最后将组织玻片封固在光学树脂胶内。制好的组织玻片可长期保存。,第二节 显微镜和显微技术,显微镜的目镜和物镜安装在镜筒的两端，它们的距离是固定的。将组织玻片放在载物台上，旋转粗调螺旋使载物台接近物镜。组织切片进入物镜第一焦平面，目镜内即可见标本内的组织影像。然后用细

23、调螺旋使目镜内的影像清晰即可进行观察。改换放大倍数时就要调换目镜或物镜。,第二节 显微镜和显微技术,暗视野显微镜 -在普通光学显微镜台下配一个暗视野聚光器,来自下面光源的光线被抛物面聚光器反射，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因此视野是暗的，视野中直径大于 0.3m的微粒将光线散射，其大小和形态可清楚看到。甚至可看到普通明视野显微镜中看不见的几个毫微米的微粒。因此在某些细菌、细胞等活体检查中常常使用。,第二节 显微镜和显微技术,荧光显微镜 -在短光波(紫外光或紫蓝色光,波长250400nm）照射下，某些物质吸收光能，受到激发并释放出一种能量降级的较长的光波（蓝、绿、黄或红光，波长4

24、00800nm），这种光称荧光。,第二节 显微镜和显微技术,某种物质在短光波照射下即可发生荧光，如组织内大部分脂质和蛋白质经照射均可发出淡蓝色荧光，称为自发性荧光。但大部分物质需要用荧光染料（如吖啶橙、异硫氰酸荧光素等）染色后，在短光波照射下才能发出荧光。,第二节 显微镜和显微技术,荧光显微镜的光源为高压汞灯，发出的紫外光源经过激发滤光片(此滤光片可通过对标本中荧光物质合宜的激发光)过滤后射向普勒姆氏分色镜,分色镜将激发光向下反射,通过物镜投射向经荧光染料染色的标本。 染料被激发并释放出荧光,通过物镜,穿过分色镜和目镜即可进行观察。目镜下方安置有屏障滤片(只允许特定波长的荧光通过)以保护眼睛及

25、降低视野暗度,第二节 显微镜和显微技术,荧光显微镜的特点是灵敏度高，在暗视野中低浓度荧光染色即可显示出标本内样品的存在，其对比约为可见光显微镜的 100倍。 30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究。如用抗酸菌荧光染色法可帮助在痰中找到结核杆菌。,第二节 显微镜和显微技术,40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术，这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中，可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体. 可用以探讨病因及发病机理，如肾小球疾病的分类及诊断，乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等。在医学实验研究及疾病诊断方面的用途日益广泛。,第

26、二节 显微镜和显微技术,相差显微镜-基本结构与普通光学显微镜相同。不同之处在于： 物镜镜头上面，在物镜第二焦平面装有一块圆盘状的位相板。 聚光器下面，在聚光器第一焦平面装有环形光束，光束上刻有狭窄的缝隙可通过环形强光,第二节 显微镜和显微技术,在位相板上不同的区域涂有不同的涂层，可以分别改变未偏向波或偏向波的速度和亮度，由此两种光波出现了位相差，差了半个波长或一个波长，它们在像平面的合波就出现明暗对比，样品内的各个细节也就能看得见。,第二节 显微镜和显微技术,总之，位相显微镜是利用样品中质点折射率的不同或质点厚度的不等，产生光线的相位差，使新鲜标本不必染色就可以看到. 而且能够观察到活细胞内线

27、粒体及染色体等精细结构，还可以应用于霉菌、细菌、病毒等更微小活体的研究，进行标本形态、数量、活动及分裂、繁殖等生物学行为观察，并可进行量度与比较。,第二节 显微镜和显微技术,倒置式显微镜 -普通显微镜的物镜头方向向下接近标本。倒置式显微镜的物镜镜头则处于垂直向上的位置，因此目镜和镜筒的纵轴与物镜的纵轴呈45度角。载物台面积较大，在物镜上方，载物台上方有一个长焦距聚光器和照明光源。物镜和聚光器可装配位相显微镜的附件。,第二节 显微镜和显微技术,组织培养瓶和培养皿可以直接放在载物台上，进行不染色新鲜标本及活体、细胞的形态、数量和动态观察。可进行多孔微量生物化学及免疫反应平板的结果观察。倒置式显微镜

28、可换用普通亮视野光学镜头；可装配偏振光、微分干涉差、荧光附件进行观察。,第二节 显微镜和显微技术,摄影显微镜 -现代高质量显微镜均可安装显微照相的各种附件，可以及时完整地保留科学资料。用于照相的显微镜要求光学系统和机件结构精密，镜体坚固稳定。它装配三目镜筒，其中两个45角观察用目镜镜筒和一个中央垂直镜筒安装 照相机、曝光测量附件、照相目镜及取景镜头，可以进行取景和调焦。,第二节 显微镜和显微技术,聚光器能调节视场中心并配有孔径光阑使视场照明均匀。镜座有可调节视场光阑，有电压表和电压显示灯。有可变电阻调节照明亮度。照明光源为612伏40100瓦卤素灯泡。80年代的自动曝光显微照相装置具有自动卷片

29、，自动测光、自动控制曝光，测量和调整色温以及倒易律失效的补偿等各项功能，均用电子计算机自动控制，可以进行黑白感光片、彩色负片和彩色幻灯片的投照。,第二节 显微镜和显微技术,电子显微镜-电子射线为电子光源的显微镜。现代医学和生物学使用的电镜分辨率为510,即放大率为1020万倍。 由于标本厚薄不同，超薄切片机切出的很薄的标本，可用透射式电子显微镜观察。不能切得很薄的标本可用扫描式电镜进行观察。,第二节 显微镜和显微技术,透射式电子显微镜(TEM) 是最常用的电子显微镜，由电子枪、电磁透镜系统、荧光屏（或照相机）、镜筒、镜座、变压器、稳压装置、高压电缆、真空泵系统、操纵台等部分组成,电子枪相当于光

30、学显微镜中的光源,供应和加速从阴极热钨丝发射出来的电子束。,第二节 显微镜和显微技术,电镜所用的电压一般在2030万伏特，才足以使电子枪里的电子以高速飞出。电子通过聚光透镜，达到标本上，因为标本很薄，高速电子可以透过，并且由于标本各部分的厚度或密度不同，通过的电子就有疏密之分。电压需要严格稳定才能使成像稳定，很小的电压改变就会引起严重干扰。像的亮度可以通过电子枪来控制。,第二节 显微镜和显微技术,扫描式电子显微镜(SEM) 标本较厚的表面要产生一个电子光学图像就要采用电子扫描法。扫描电镜的电子枪和电磁透镜的结构原理类似透射电镜。电子枪产生的大量电子通过三组电磁透镜的连续会聚形成一条很细的电子射

31、线（电子探针）。这条电子射线在电镜筒内两对偏转线圈的作用下，顺序在标本表面扫描。,第二节 显微镜和显微技术,由于来自锯齿波发生器的电流同时供应电镜镜筒内和显示管的两组偏转线圈，使得显示器的电子射线在荧光屏上产生同步扫描。从标本上射出的电子经探测器收集，被视频放大器放大并控制显示管亮度。因此在荧光屏上扫描的亮度被标本表面相应点所产生的电子数量所控制，因而在荧光屏上显示出标本的高倍放大像。,第二节 显微镜和显微技术,扫描电镜标本制作中，既要脱水又要基本保持其自然状态，因此使用标本的临界冷冻干燥技术：将组织表面清洗干净，经戊二醛和四氧化锇双重固定，逐级丙酮脱水。由于乙酸戊酯与液化Co置换十分容易,因

32、此首先用梯度乙酸戊酯置换丙酮。,第二节 显微镜和显微技术,然后将标本放入密闭耐压室内，导入液态Co，使之浸没标本。很快Co将标本内乙酸戊酯完全置换出来，将后者排出耐压室。同时耐压室内的液态Co与迅速蒸发的气态Co分子之间的互变达到动态平衡。使温度逐渐上升,液态Co蒸发加快而密度相应降低。达到Co的临界温度31.1时,气、液二相密度相同，二相的差异完全消失，即达到相的平衡，此时表面张力为零。,第二节 显微镜和显微技术,使温度继续保持在稍高于临界温度的条件下，缓慢排出Co气体,当Co排尽时,标本即已干燥。取出干燥好的标本，经真空喷镀一层碳合金，或放入离子镀膜机内镀铂和金，以增加标本的导电能力，加强

33、反差和增强标本的稳定性。然后即可直接观察脱氧核糖进行扫描电镜观察。,第二节 显微镜和显微技术,扫描电镜具有分辨率高、景深长、视野广、显示三维立体结构、便于观察和标本制备简单等许多优点，在生物学及医学上应用愈来愈多，用以观察和研究生物标本的表现形态和内部立体结构。,第三节 显微镜下的微生物,球菌(coccus),脑膜炎奈瑟菌,双球菌(diplococcus),链球菌(streptococcus),球菌(coccus),球菌(coccus),葡萄球菌(streptococcus),球菌(coccus),四联球菌(tetrad),球菌(coccus),八叠球菌(sarcina),杆菌(bacillus),不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。,杆菌的形态多样,杆菌(bacillus),杆菌(bacillus),杆菌的形态多样,分枝杆菌,双歧杆菌,螺形菌(spiral bacterium),荚膜： 某些细菌在其细胞壁外包绕一层黏液性物质，为疏水性多糖或蛋白质的多聚体，用理化方法去除后并不影响细胞的生命活动。,鞭毛-许多细菌在菌体上附有细长并呈波状弯曲的丝状物，称为，是细菌的运动器官。 鞭毛需用电子显微镜观察，或经特殊染色法使鞭毛增粗后才能在光镜下看到。,鞭毛菌分类,单毛菌,双毛菌,丛毛菌,周毛菌,透射电镜,扫描电镜,