第6节载体系统.ppt

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1、第六节 载体系统,1 质粒载体 2 噬菌体载体 3 cosmid克隆载体 4 噬菌粒载体 5 酵母人工染色体载体 6 细菌人工染色体载体,1 质粒载体,1.1 质粒的一般生物学特性 1.2 基因工程中的质粒载体 1.3 pBR322质粒载体 1.4 pUC质粒载体 1.5 穿梭质粒载体 1.6 质粒载体的稳定性问题,1.1 质粒的一般生物学特性,1.1.1 质粒的概念 质粒（plasmid）是独立于染色体外、具有自主复制能力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在1kb-200kb以上不等。,1.1.2 细菌质粒的一般生物学特性 (1) 很多细菌中已发现； (2) 是独立于细菌染色体之外

2、的辅助性遗传单位，基因组绝大部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异； (3) 大多数质粒的宿主范围较窄；,(4)已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。 (5)复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质； (6)常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。,共价闭合环形DNA （scDNA型）,开环DNA （ocDNA）,线性DNA （cccDNA）,环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型,1.1.3 质粒的命名,用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。 如：pBR322：

3、p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。,1.1.4 质粒给宿主细胞的标记,(1) 氨苄青霉素 (Ampicillin ) (2) 卡那霉素 (Kanamycin) (3) 四环素（Tetracycline） (4) 氯霉素(Chloramphenicol) (5) 链霉素（Streptomycin） (6）潮霉素（Hygromycin ）,1.1.5 质粒的复制类型,据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为： （1）“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid)：拷贝数少 ； （2）“松弛型”复

4、制控制的质粒(relaxed plasmid)：拷贝数多。,1.1.6 质粒DNA的转移,质粒的类型 据能否自我转移可分为: 接合型（conjugative plasmid) 非接合型（non-conjugative plasmid) (2) F质粒(fertility factor) F+ 又叫雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，相应的 F 又叫雌性细胞。 F质粒(约94kb)在寄主细胞中有三种不同存在方式： F+ F Hfr。,1.1.7 质粒的转化,转化（transformation）： 是将异源DNA分子引入另一细胞品系， 使受体细胞获得新遗传性状的一种手段。 质粒转化细菌常用方法

5、：热激法、电击法,1.2 基因工程中的质粒载体,1.2.1 两个概念 克隆载体(cloning vector) : 使目的片段能在细菌细胞中复制的载体; 表达载体（Expression Vector ）: 使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白质的载体。,1.2.2 克隆载体必备条件,（1）具有复制起点 （2）具有抗菌素抗性基因 （3）具有若干限制酶单一识别位点 （4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。,1.2.3 表达载体的必备条件,(1)能自主复制 (2)具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记 (3)具有能为 RNA聚合酶识别的强大启动子 (4)启动子应可受诱导调控 (5)具有强终止子

6、 (6)具有翻译起始信号,1.2.4 天然质粒用作载体的局限性,局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适,1.2.5 质粒载体的选择标记,常用的选择标记： 抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素和抗卡那霉素等基因。 选择标记的应用： 利用质粒编码的可选择标记产物选择目标菌落。,1.3 pBR322质粒载体,pBR322质粒载体的形体图,pBR322质粒载体的结构来源,Tetr,pBR322质粒载体的优点： 具有较小的相对分子质量(4363bp) 具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号(Ampr和Tetr) 具有较高的拷贝数（15个,松弛型）,DNA连接酶,pBR322质

7、粒载体tetr基因插入失活效应,1.4 pUC质粒载体,pUC18,pUC19,含四个部分： （1）来自pBR322的质粒复制起点（ori）； （2）ampr ; （3）大肠杆菌半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列； （4）多克隆位点（MCS）,lacZ,Ori,Ampr,MCS,Blue White,ampr,ampr,Insert,Insert,No insert,Lac Z,Lac Z,具更小的分子质量(2.69kb)和更 高的拷贝数(500 - 700个) 适于组织化学方法检测重组体 具多克隆位点MCS区段,pUC质粒载体的优点,1.5 穿梭质粒载体 （shut

8、tle plasmid vector） 是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。,大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体,其它重要的质粒载体,改造过的质粒载体非常多,能在体外转录克隆基因的质粒载体,1.6 质粒载体的稳定性问题,（1）不稳定性类型 分离不稳定性 结构不稳定性 （2）影响稳定性主要因素 新陈代谢负荷 拷贝数差度,2 噬菌体载体,2.1 噬菌体的结构及其核酸类型 2.2 噬菌体的生命周期 2.3 噬菌体载体 2.4 M13噬菌体载体,2.1 噬菌体的结构及其核酸类型,不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大差别。 三种不同基本类型：

9、无尾部的二十面体型 具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形） 线状体型,T2噬菌体结构示意图,双链线性DNA（最常见） 双链环形DNA 单链环形DNA 单链线性DNA 单链RNA,噬菌体的核酸：,2.2 噬菌体的生命周期,（1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体） （2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）,（1）烈性噬菌体的生活周期,t=0 噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入； t=1 寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭； t=2 第一个噬菌体mRNA开始合成； t=3 细菌DNA开始降解； t=5 噬菌体DNA合成开始启动； t=9 “晚期”噬菌体

10、mRNA开始合成； t=12 出现完整的头部和尾部结构； t=15 出现头一个完整的噬菌体颗粒； t=22 细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒,E.coli T4噬菌体的生命周期（以分钟记）,cI OR PR,PL OL,基因,早期左向转录,早期右向转录,基因,噬菌体的阻遏-操纵基因系统,CI=阻遏基因； P=启动子；O=操纵基因；L=左向；R=右向,注：cI基因和cro基因编码的蛋白质，同两个操纵基因（OL， OR）之间的相互作用决定是发生溶菌反应还是溶源反应，如这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，则进入溶菌周期。,2.3 噬菌体载体,2.3.1 噬菌体的分子生物学概述 2.3

11、.2 噬菌体载体,2.3.1 噬菌体的分子生物学概述,噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48 502bp，两端各有12个碱基的5凸出黏性末端是互补的。进入细胞的DNA通过两端的黏性末端环化。 噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。,噬菌体DNA的核酸内切限制酶的限制图（Kb）,2.3.2 噬菌体载体,主要有如下特点： (1)筛选简便； (2)可克隆的片段大，最大可达23 kb，而质粒最大仅10 kb左右； (3)转化效率高。,噬菌体载体可分为： 插入型载体 替换型载体,注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 38kb 52kb。 体外包装：噬菌载体 + 尾部蛋白

12、 + 头部蛋白,噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。,4 M13噬菌体载体,6.4 kb单链环状正链DNA基因组。 作载体的优点： (1) 单链DNA噬菌的复制,是以双链环形DNA为中间媒介, 这种复制形式的DNA,可以同质粒DNA一样,在体外进行纯化和操作； (2) RF DNA 和SS DNA都可感染E.coli，产生噬菌斑； (3) 无包装限制问题（可6倍于M13基因组）； (4）易测出外源DNA的插入方向； (5）可产生能直接测序的单链DNA分子。,5 cosmid克隆载体,cosmid（cos site-carring plasmid） 人工构建的含有

13、DNA的cos（cohesive-end site)位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。,pHC79 6.4 kb,柯斯质粒载体pHC79的形体图 由pBR322质粒DNA与噬菌体DNA的cos位点及其控制包装作用的序列构成,部分柯斯质粒的基本特性,柯斯质粒载体的特点： （1）具有噬菌体的特性（但因不含噬菌体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）； （2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）； （3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极限可达45kb左右）； （4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。 广泛应用于基因组DNA文库的构建。,柯斯克隆（

14、cosmid cloning）,理论依据是： 1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（cos位点)。 2）在噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个DNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个DNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。 3）噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-specific cutting system),又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成单位长度的片段，并将它们包装到噬菌体头部中去。,(如EcoR I),38kb52kb,应用柯斯质粒作载体构建基因组文库的一般程序,四 噬菌粒

15、载体（phagemid vector),由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）,几种常用的噬菌粒载体的一般特征,pUC119(MCS),pUC118(MCS),puC118和pUC119噬菌粒载体的分子结构,（1）无辅助噬菌体时pUC118/pUC119的复制,亲本pUC质粒,（2）有辅助噬菌体时pUC118/pUC119的复制,M13辅助噬菌体的基因组,pUC118/pUC119噬菌粒载体的两种复制模型,噬菌粒载体的优点,（1）具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组DNA，可克隆高达10 kb的外源DNA； （2）有ampr 等基因

16、作为选择记号； （3）拷贝数高； （4）存在多克隆位点,可克隆达10 kb的外源DNA；,（5）可用组织化学显色反应筛选重组子； （6）具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源基因可按质粒一样复制； （7）有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中，可合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中。 (8) 可直接对克隆的基因进行核苷酸测序。,(yeast artificial chromosome, YAC),真核生物染色体的几个最为重要的部位： 端粒重复序列（telomeric repeat ， TEL） 着丝粒（centromere ， CEN） 自主复制序列（a

17、utonomously replication sequences，ARS） YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2,YAC本身可小至8 kb（如pYAC2质粒），克隆能力可达1000 kb以上。,五 酵母人工染色体载体,(bacterial artificial chromosome, BAC),BAC载体是建立在大肠杆菌的F因子（大小约100kb）的基因础上； 人工构建的BAC较小（如pBeloBAC11仅有7.4 kb，保留了与F因子的自主复制、拷贝数控制及质粒分配等功能相关基因），但其克隆能力可达300 kb以上，远大于柯斯质粒，但小于YAC。,六 细菌人工染色体载体,