第7章吸光光度法.ppt

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1、19.6.15,1,第7章 吸 光 光 度 法,Spectrophotometry,19.6.15,2,7.1光吸收基本定律 7.2 分光光度计 7.3 显色反应及影响因素 7.4 吸光光度分析及误差控制 7.5 吸光光度分析法的应用,19.6.15,3,吸光光度法是基干物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。 方法特点： 一、灵敏度高：1%10-5% 二、准确度高：目视5%10%，仪器2%5% 三、快速简便 四、应用广泛:绝大多数无机离子，有机化合物,19.6.15,4,7.1 光吸收基本定律,c真空中光速 2.99792458108m/s 波长，单位：m,cm,mm,m,nm, 1m=1

2、0-6m, 1nm=10-9m, 1=10-10m 频率，单位：赫芝（周）Hz 次/秒 n折射率，真空中为1,1. 波动性,7.1.1.光的基本性质 一、光是一种电磁波 - 波粒二象性,19.6.15,5,2. 微粒性,h普朗克(Planck)常数 6.62610-34Js 频率 E光量子具有的能量 单位：J(焦耳)，eV(电子伏特),光量子，具有能量。,19.6.15,6,3. 波粒二象性,结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越 长(频率越低)，光量子的能量越低。 单色光：具有相同能量(相同波长)的光。 复合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在 一起。 电磁波谱的波段如何划分?,真空中:

3、,19.6.15,7,4电磁波谱(Electromagnetic waves),电磁辐射按波长顺序排列：,射线 X 射线紫外光可见光红外光微波无线电波,19.6.15,8,二、光的互补关系,可见光白光（复合光）：由不同波长的光按 一定比例复合而成 单色光：波长处于某一范围的光（理论：同一波长） 互补光：如果两种单色光按一定强度比例混合后到白光，这两种单色光称为互补色,19.6.15,9,不同颜色的可见光波长及其互补光,19.6.15,10,三、吸收曲线,当白光通过某一有色溶液时，该溶液会选择性 地吸收某些波长(wavelength)的光而让未被吸收 的光透射过，呈现的是它吸收光的互补光的颜色

4、例如，KMnO4溶液选择吸收了白光中的绿色(500560nm)光，与绿色光互补的紫色光因未被吸收而透过溶液，所以KMnO4溶液呈现紫色。,19.6.15,11,将一系列不同波长的单色光依次通过某一吸光物质，测量该物质对光的吸收程度（吸光度），作吸光度（A）入曲线：吸收曲线,吸收曲线：,19.6.15,12,吸收曲线 (absorption spectrum),19.6.15,13,吸收曲线的讨论：,1.在入525nm，吸收最大 入max 2. 浓度改变 入max不变 （同种溶液） 浓度越大，吸光度越大,19.6.15,14,7.1.2 光吸收的基本定律,一. 朗伯比尔定律(Lamberts l

5、aw),透光度(T)与吸光度(A),I0= It+Ia+ Ir,A = lg (I0/It),19.6.15,15,2.吸收定律,A=kbc,A 吸光度(absorbance) b 介质厚度(length/cm) c 浓度(concentration) K 吸光系数(absorptivity),当一束平行单色光垂直通过均匀，非散射的吸光物质时， 其吸光度A与吸收物质的浓度c及吸收层厚度b成正比。,19.6.15,16,A,T,C之间的关系,A = lg (I0/It) A = lg(1/T),19.6.15,17,吸光度(A)、透光率(T)与浓度(c)的关系,19.6.15,18,二、摩尔吸光

6、系数和桑德尔灵敏度,1.摩尔吸光系数：: Lmol-1cm-1,当c的单位用molL-1表示时，用表示.(b ： cm ) 摩尔吸光系数(Molar absorptivity) A bc,物理意义：在一定温度下，当吸光物质的浓度为 1 molL时，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。 反映了吸光物质进行光度测定的灵敏度,19.6.15,19,摩尔吸光系数()的讨论,吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，可作为定性鉴定的参数； 与吸收物质本身的性质有关； 同一吸收物质在不同波长下的值是不同的。 在最大吸收波长max处的摩尔吸光系数，常以max表示。max表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反

7、映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。,max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。,19.6.15,20,朗伯-比尔定律的适用条件 单色光: 应选用max处或肩峰处测定 吸光质点形式不变：离解、络合、缔合会破坏线性关系， 应控制条件(酸度、浓度、介质等) 稀溶液： 浓度增大，分子之间作用增强,19.6.15,21,2.桑德尔灵敏度：Sgm2,当光度仪器的检测极限为0.001时，单位截面积光柱内所能检出的吸光物质的最低质量，用S表示。S越小，越灵敏 经推导： S=M/ gm2 一般：S在0.010.001 gm2,19.6.15,22,分光光度计的类型,7.2 分光

8、光度计,19.6.15,23,19.6.15,24,1. 光源(Light source)：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯(320 2500 nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180 375 nm) 2. 单色器(monochromator)：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。 棱镜:玻璃350 3200 nm, 石英185 4000 nm 光栅:波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使用方便,19.6.15,25,单色器,棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,19.6.15,26,光栅：,在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600

9、、1200、2400条/mm )。,原理： 利用光通过光栅时 发生衍射和干涉现象而分光.,19.6.15,27,光栅,19.6.15,28,3.吸收池(cell):用于盛待测及参比溶液。,玻璃 能吸收UV光，仅适用于可见光区 石英 不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区,4. 检测器(detector)：利用光电效应，将光能转成电流讯号。 光电池，光电管，光电倍增管 5. 显示装置(display),19.6.15,29,722型分光光度计结构方框图,光源,吸收池,检测系统,分光系统,显示系统,19.6.15,30,19.6.15,31,7.3 显色反应及影响因素,一、 显色反应的选择 1 灵敏度

10、高(High sensitivity)，一般104 2 有色化合物组成恒定，符合一定的化学式。性质稳定显色条件易于控制，重现性好。 3 显色剂在测定波长处无明显吸收。 对比度好, max60 nm . 二、显色剂(Color reagents) 无机显色剂: Fe(SCN)2+，TiOH2O22+ 有机显色剂:,7.3.1 显色反应和显色剂(Color reactions),19.6.15,32,有机显色剂:,生色团（生色团） 能吸收紫外-可见光的基团 有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团产生n *跃迁和 *跃迁, 跃迁E较低,注：当出现几个生色团共轭，则几个生色团所产生的吸收带将消失，

11、代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个生色团的吸收波长长，强度也增强,19.6.15,33,助色团,本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时 使吸收峰长移（红移）的基团 有机物：连有杂原子的饱和基团 例：OH，OR，NH，NR2，X,19.6.15,34,红移,由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基 ）或采用不同溶剂后，吸收峰位置向长波方向的 移动，叫红移(Bathochromic shift）.,19.6.15,35,有机显色剂,19.6.15,36,7.3.2 显色条件的选择,1、显色剂用量,Mo(SCN)32+ 浅红 Mo(SCN)5 橙红 Mo(SCN)6- 浅红,Fe(SCN

12、)n3-n,19.6.15,37,二、溶液的酸度,pH1pHpH2,pH,19.6.15,38,酸度的影响,pH3.55.7为适宜的酸度范围,19.6.15,39,三、显色时间和显色温度,T1(),T2(),t(min),19.6.15,40,四，溶剂,降低有色化合物的解离度； 提高反应速率； 有色化合物的溶解度等。,19.6.15,41,7.4 吸光光度分析及误差控制,7.4.1 测定波长的选择、标准曲线制作,吸收最大，干扰最小,吸收最大，干扰最小,19.6.15,42,标准曲线制作,在一定条件下，测量一系列不同浓度的标准溶液的吸光度，作A-C曲线,19.6.15,43,7.4.2 引起偏离

13、朗伯 比耳定律的因素,主要因素表现为 以下两个方面,1. 物理(光学)因素 2. 化学因素,19.6.15,44,一、物理因素,1.非单色光的影响 Beer定律应用的重要前提入射光为单色光,19.6.15,45,2.入射光不平行，不垂直 3.介质不均匀,有反射，散射现象，吸光度偏高 散射和反射使T，A，吸收光谱变形 注：一般可用空白对比校正消除,19.6.15,46,二、化学因素,浓度过高，吸光质点之间作用 改变 化学反应,浓度发生变化 以C代替平衡浓度 解离 络合 使C与平衡浓度的正比关系破坏 缔合,19.6.15,47,三、干扰及消除,19.6.15,48,如测Fe3,磺基水杨酸,. 控制

14、酸度,2.消除干扰方法,19.6.15,49,.掩蔽法,或,Co2, Fe3+,Co2+ FeF63-,Co(SCN)2,NaF,SCN,Co2+、Fe2+、Sn4+,SnCl2,Co(SCN)2,SCN,测Co2(含Fe3+),络合掩蔽法,氧化还原掩蔽法,19.6.15,50,. 增加显色剂用量 .选择适当的测量条件，适当波长，参比溶液 .分离干扰离子,19.6.15,51,试液 显色剂（试剂） 参比液 无 无 蒸馏水（或试+显） 有色（共存离子） 无 试液+试剂 无 有 显色+试 有（共存） 有 一份+掩蔽剂+显+试,选择适当参比液 什么是参比液：用来调节仪器A为零的溶液，作为相对标准，抵

15、消其他试剂对光的吸收。,19.6.15,52,7.4.3 仪器测量误差,光度计的读数误差：对于一定的仪器，其读数误差T 是一定的，一般0.002-0.01，相对误差为0.22(T/T),由于T与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的T引起的误差不同。,19.6.15,53,19.6.15,54,仪器测量误差,19.6.15,55,浓度测量的相对误差与T(或A)的关系,19.6.15,56,7.5 吸光光度分析法的应用 7.5.1 方法介绍 一.目视比色法,士壤中磷的测定,H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3 =(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O,磷钼黄(小)

16、,磷钼(V)蓝(大),19.6.15,57,方便、灵敏，准确度差。,目视比色法,19.6.15,58,二. 示差吸光光度法,当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示 差法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液 浓度的标准溶液作参比溶液。 设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs cx)。 则： Ax= b cx， As = b cs =x s =b(cx cs ）=bc 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液 的吸光度之差。由标准曲线上查得相应的c值， 则待测溶液浓度cx ： cx = cs + c,19.6.15,59,示差法标尺扩展原理：,普通法： cs的T=1

17、0%；cx的T=5% 示差法： cs 做参比，调T=100% 则： cx的T=50% ；标尺扩展10倍,19.6.15,60,三. 双波长吸光光度法,1.原理：两束波长不同的单色光，以一定的频率交替照到装有试液的吸收池，测出不同波长入1，入2处的吸光度差 （以测量波长相近的波长的A作参比）不需空白溶液作参比；来消除干扰。 2.作用：在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。,A A2 A1 (2 1)b c,19.6.15,61,A A2 A1 (2 1)b c 两波长处测得的吸光度差值A与待测组分浓度c成正比。1和2分别表示

18、待测组分在1和2处的摩尔吸光系数。 测量波长2和参比波长1的选择与组合,19.6.15,62,基本要求：,在选定的两个波长1和2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。,选定的波长1和2处干扰组分应具有相同吸光度(等吸收点)，即：Ay = A y2 A y1 = 0 故：Ax+y = A x=(x2x1)bcx 此时：测得的吸光度差A只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。,19.6.15,63,混浊试液中组分的测定,A 1 -A 2 = A Ac,例 牛奶中微量Fe的测定,选择 入Max测量；选择与入max相差40-m0nm的波长为参比

19、波长,19.6.15,64,双组分共存时的分别测定,在2， A2 = Ax2+Ay2 在1， A1= Ax1+Ay1,A= A2 - A1 = Ax2+Ay2 (Ax1+Ay1) = Ax2 Ax1 = Ax,Ay2 Ay1,Ax =(x2 x1)bcx 消除了y的干扰,19.6.15,65,四. 导数光度分析法（自学）,导数光谱：吸光度随波长变化率对波长的曲线 吸光度的导数值与浓度成正比,19.6.15,66,7.5.2 方法应用,一.单组分分析： 痕量金属分析 二. 临床分析 三.食品分析 四. 其他应用 一、 弱酸和弱碱离解常数的测定 二、络合物组成的测定,19.6.15,67,一. 弱

20、酸和弱碱离解常数的测定,HA HA,KaH+A/HA,高酸度下，几乎全部以HA存在，可测得AHA=HAc(HA)； 低酸度下，几乎全部以A存在，可测得 AA Ac(HA). 代入整理：,配制一系列c相同,pH不同的溶液,测A(设b=1cm).,19.6.15,68,MO吸收曲线,由每份溶液的一对pH、A，可求得一个Ka, 取平均值即可.,19.6.15,69,二.络合物组成的测定 （无机已学）,1.摩尔比法: 固定cM ,改变cR,19.6.15,70,2.等摩尔连续变化法:,19.6.15,71,条件形成常数的测定 (设M、R均无吸收),cM + cR= c,MmRn型 ?,19.6.15,72,作业：p337-339. 2，3，4，8， p337.思考题：3，8,