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1、第七章 酶,一、酶通论,1. 概述 the early 1800s Biological catalysis was first recognized and described 1850s Louis Pasteur concluded that fermentation of sugar into alcohol by yeast is catalyzed by “ferments.“ 1897 Eduard Buchner discovered that yeast extracts can ferment sugar to alcohol 1926 James Sumner isola
2、ted and crystallized the urease 1930s John Northrop crystallized pepsin and trypsin and found them also to be proteins 1980s Cech and Altman found ribozyme,1.1 酶的催化特点 催化效率高； 酶的作用具有高度的专一性； 酶的作用条件温和，易失活； 酶的活力是受到调控的； 酶的催化活力与辅酶、辅基及辅助因子有关。,1.2 酶的本质及组成 With the exception of a small group of catalytic RNA
3、molecules , all enzymes are proteins. 全酶(holoenzyme) = 脱辅酶(apoenzyme) + 辅因子(cofactor),1. 3 酶的命名 习惯命名法 国际系统命名法： 明确地标明了酶的底物(底物之间用“：”隔开)和催 化反应的性质，且每一种酶都有唯一确定的一个编号。 如： 习惯名称 系统命名 编号 谷丙转氨酶 丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶 EC2.6.1.2,（1） 氧化还原酶类： 催化氧化还原反应的酶。 氧化酶类：有O2参与脱氢反应； 脱氢酶类：没有O2参与脱氢反应； （2） 转移酶类： 催化一种分子上的基团转移到另一个分子上。 （3）
4、水解酶类： 催化H2O参与下的分解反应或其逆反应。,（4） 裂合酶类： 催化一个分子裂分为两个分子的反应或其逆反应。 （5） 异构酶类： 催化同分异构体之间互变反应的酶。 （6） 连接酶类： 催化ATP参与下，两个物质合成一个新物质的反应。,1. 3 酶的专一性 绝对专一性 结构专一性 基团专一性 相对专一性 键专一性 旋光异构专一性 立体异构专一性 几何异构专一性,二、 酶促反应动力学,G,中间络合物学说,一级反应,混和级反应,零级反应,底物浓度对酶反应速度的影响,2. 1 酶促反应的动力学方程式： 米氏方程,米氏方程的推导：,设 Km(k2 + k-1)/k1,又有 ES=Vo/K2,从米
5、氏公式可以看出： 当酶浓度确定时，Vmax和Km 是常数，所以V是S的一元函 数； 当S Km时，Vo =Vmax; 当S Km时， Vo = Vmax/Km S ，反应速 度和底物浓度的关系近似于直 线函数关系。 (4) 当S=Km 时， Vo =1/2 Vmax,Km的意义： 由于Km(k2 + k-1)/k1，说明Km是反应速度常数的函数，而反应速度常数是由酶的反应性质和酶反应的条件决定的，所以对一个特定的反应来说， Km是一个特征常数，大小与酶浓度无关，而与具体的底物有关； 从Km值可以判断酶的专一性和天然底物；1/ Km可以近似表示酶对底物的亲和力的大小， 1/ Km越大，酶和底物的
6、亲和力越大； 在Km(k2 + k-1)/k1 中，当k2 k-1 ，Km = k-1/k1 ，这时Km可以可看作ES的解离常数 Ks ，所以Km越大，即解离常数越大，表示E和S结合弱，ES不稳定。, 从Km值的大小可以知道正确测定酶活力时所需要的底物浓度。 从Km值还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢 路线。同一个底物往往可以被几种酶作用，发生不同的 反应，其中Km值小的酶反应占优势。 乳酸脱氫酶 1.710-5 丙酮酸脱氢酶 1.310-3 丙酮酸脱羧酶 1 10-3,Vmax=K2Et=Kcat E,Kcat：催化常数，又称为酶的转换数，表示酶被底物饱和的时候，每秒种每个酶分子转换底物的
7、分子数（单位是S-1）。Kcat越大， 表示酶的催化效率越高。,在生理条件下， 大多数酶并不被底物饱和，所以这时的Kcat不能真实反映酶的催化效率。,在生理条件下， 当SEt时， Vo = （Kcat/Km）Et S 所以， 这时用Kcat/Km来作为酶的催化效率更恰当。,Lineweaver-Burk双倒数作图法求Km、Vmax,2.2 多底物的酶促反应动力学 A + B = P + Q (1) 序列反应,（2） 随机反应,（3） 乒乓反应,三、 酶的抑制作用,1. 抑制与失活的区别 2. 抑制程度的表示方法 相对活力分数 抑制分数 3. 抑制作用的类型,不可逆抑制剂,可逆抑制剂,可逆抑制与
8、不可逆抑制作用的鉴别,V,E,1,2,3,E,V,I,I,（一）可逆抑制作用动力学 1. 竞争性抑制作用： 抑制剂和底物竞争酶的结合部位。,2. 非竞争性抑制作用： 底物和抑制剂可以同时和酶结合， 没有竞争现象，但结合了抑制剂后不能再分解为产物。,3. 反竞争性抑制： 酶只有与底物结合后才能与抑制剂结合，但结合抑制剂后不能转化为产物。,（二） 重要的抑制剂 1. 不可逆抑制剂 1.1 非专一性不可逆抑制剂： 有机磷化物、有机汞(砷)化物、重金属盐、烷化剂 青霉素、氰化物,1. 2 专一性的不可逆抑制剂 Ks型不可逆抑制剂：具有与酶的天然底物类似的结构。与酶结合后，利用所带的活性基团使酶的必需部
9、位被共价修饰，抑制酶的活性。但所带的活泼基团也可以修饰酶的别的部位，所以该抑制剂的专一程度有限。又称为“亲和标记试剂”。 Kcat型不可逆抑制剂：也具有与酶的天然底物类似的结构，且本身能被酶作用，使潜伏的基团活化而作用于酶的必需基团，酶被不可逆失活。又称为“自杀性底物”。,2 . 可逆抑制剂 （1） 抗代谢物：磺胺药、5FU等,（2） 过渡态类似物： 化学结构类似于底物和酶结合的过渡形式的一类抑制剂。,四、影响酶作用的因素,1. 温度对酶反应的影响 2. pH对酶反应的影响 3. 激活剂对酶反应的影响,六、酶的作用机制,（一）酶的活性中心 酶的活性中心是指酶分子中能同底物结合并起催化反应的空间
10、部位，包括结合位点和催化位点。酶的活性中心形态及酶的性质取决于整个酶的结构，最终取决于组成酶的肽链的氨基酸序列。 酶的活性中心的特点： （1）活性中心只占整个酶体积的很小的一部分； （2）活性中心是一个具有三维空间构型的实体； （3）底物和酶在活性中心的结合力属于弱相互作用； （4）活性中心通常是一个裂缝，适合于底物的进入。 （5）活性中心的结构具有柔性，是可变的。,（二） 研究酶活性部位的方法 1. 侧链基团的化学修饰法 a 非特异性的共价修饰法 b 特异性的共价修饰法,c 亲和标记法：与底物结构相似的共价修饰剂 如 TPCK、TLCK、TLME等。,2. X-射线晶体衍射法 3. 定点诱变
11、法 定点突变的方法改变编码蛋白质的DNA的顺序，通过判断突变前后酶活性的变化来研究酶的活性中心。,生化反应得以进行需要克服的能垒包括：, 酶分子上催化功能基团的正确定位；,酶和底物的相互作用，可以克服以上的能垒：, 通过底物在酶分子表面的定位，可以大大提高底物的局部浓度；, 酶-底物的相互作用可以置换绝大多数的底物-水之间的氢键；, 酶-底物相互作用时释放的Binding energy可以补偿底物分子形变所需的热能；, 酶-底物的相互作用使酶发生诱导契合，这种形变又加强了酶-底物的相互作用；, 反应物的无规则运动；, 生物分子表面通过氢键形成的水化膜；, 底物分子电荷和结构的重新排布；,（三）
12、影响酶催化效率的因素 1. 酶和底物的邻近和定向效应 邻近效应是指通过底物在酶分子表面的定位从而大大提高底物的局部浓度，使反应速度加快的效应。 定向效应是指底物在酶的作用下，采取有利于反应进行的取向。,2. 酶和底物的诱导契合 底物在酶的作用下，某些基团的电子云密度发生改变，产生电子张力，底物分子形变，导致反应易于进行的效应。,3. 酸碱催化效应 酶通过向底物分子提供瞬时的质子或接受瞬时的质子而稳定酶-底物复合物，加快反应进行的效应。,4. 共价催化效应 酶和底物生成不稳定的共价中间物，该中间物容易转变成过渡态，从而大大降低反应活化能。共价催化的一般形式是酶的亲核基团对底物中亲电的碳原子进行亲
13、核进攻。,慢,快,快,胰蛋白酶Ser195作为亲核试剂的示意图,5. 金属离子的催化效应 （1） Ionic interactions between an enzyme-bound metal and the substrate can help orient a substrate for reaction or stabilize charged reaction transition states. 金属离子与底物形成络合物，稳定中间过渡态 金属离子通过屏蔽底物的负电荷，使亲核反应更容易进行 （2） Metals can also mediate oxidation-reduction
14、 reactions by reversible changes in the metal ions oxidation state.,6. 活性部位的疏水效应 活性部位通常位于疏水环境的裂缝中，使得酶和底物的弱相互作用力变强，有利于反应的进行。 7. 多元催化和协同效应,七、酶催化反应机制的实例,胰凝乳蛋白酶的一级结构,活性中心的构象与专一性的关系,底物进入结合部位，Ser-:OH 作亲核试剂,形成酰基酶复合物。His将H转移给NH2.,四面体中间体分解，释放产物胺。,H2O做亲核试剂进攻羰基碳,再次形成四面体中间体,四面体分解，第二个产物释放，恢复游离态的催化三联体。,用人工底物研究胰凝乳
15、蛋白酶的作用机制,八、酶活性的调控,酶含量的调节,酶活性的调节,别构效应的调节,可逆共价修饰调节,酶原的激活,激促蛋白和抑制蛋白的调控,酶的调节,（一）酶的别构调控 效应物与酶的非催化部位结合，导致酶的构象改变，进而导致活性改变的现象称为酶的别构调节。,正调节物对酶的结构和活性的影响,效应物对别构酶的影响,天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)中亚基的排列情况,催化亚基,别构酶的特点： （1）别构酶都是寡聚酶，亚基之间通过次级键组合在一起； （2）别构酶有在空间上分开的调节部位和底物结合部位；调节物通过与调节部位的结合，改变整个酶分子的构象来影响底物同酶的结合，产生或正或负的协同效应。 协同指数C
16、I（又称饱和比值Rs） Rs = 811/n,位点被饱和90时的底物浓度,位点被饱和10时的底物浓度,米氏酶：n=1, Rs81 正协同效应：n1, Rs81,（二） 酶的可逆共价修饰调节 通过其他酶对共价调节酶进行可逆的共价修饰，使酶在活性和非活性之间互变来调节酶的活性。 共价修饰的方式主要有磷酸化、腺苷酰化等。,共价修饰调节的特点： 1. 共价修饰调节反应可在体内可连续进行，逐级通过磷酸化和脱磷酸作用，实现级联放大效应，调节效果更强； 2. 磷酸化修饰仅需以ATP等高能化合物供给磷酸基团，其耗能远小于合成酶蛋白，所以是一种经济有效的方式。,调节糖原代谢的级联放大效应,（三）酶原的激活 体内
17、合成出的不具有生物活性的蛋白质在蛋白水解酶的作用下，发生不可逆的去掉部分肽段的反应，由非活性的状态变成活性状态的一种调控方式。,九、 其他特殊的酶 （一） 核酶( ribozyme) 在研究四膜虫的rRNA剪接中，发现没有任何蛋白质，rRNA的剪接也能够完成，即RNA分子本身具有酶的活性，这种由RNA发挥作用的酶称为核酶。 现已知道，某些病毒、噬菌体RNA，以及RNaseP中的M1RNA、1，4-葡萄糖分支酶中的RNA均有催化功能。,四膜虫rRNA自我剪接的过程示意图,核 酶 的 锤 头 结 构,（二）抗体酶 (abzyme) 用模拟酶与底物结合的中间过渡态而设计的化合物(称为半抗原)去免疫动
18、物，从中提取出可以催化底物化学反应的物质，就称为抗体酶。,（三）同工酶 同工酶是指同一种属中能催化同一种化学反应，但酶分子结构、组成、理化性质及免疫学性质都不同的一组酶。,十、 酶的活力测定及分离纯化,酶的活力单位U：在最适反应条件下，每分钟内催化1mol底物转化为产物所需的酶量。 1U=1mol/min 酶的Kat单位Kat：在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量。 1Kat 60 106 U 酶的比活力：每mg蛋白所含有的酶活力单位数，代表了酶的纯度。 比活力U/mg蛋白总活力U/总蛋白mg 酶的纯化倍数每一步的比活力/第一次的比活力 酶的回收率每一步的总活力/第一次的总活力,