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1、第二章 基因工程的基本条件,一、用于核酸操作的工具酶 二、基因克隆载体 三、目的基因的制备 四、基因工程受体菌或细胞,二、基因克隆载体,（一）载体的功能及特征 （二）质粒 （三）噬菌体或病毒DNA （四）Cos质粒与噬菌粒 （五）人工染色体载体,（一）载体的功能及特征,在基因工程操作中，能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子。,载体(vector)：,载体的功能：,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。,运送外源基因高效转入受体细胞；,为外源基因提供复制能力或整合能力；,载体应具备的条件：,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)；,具有合适的筛选标记。,具有较高的外源DNA载装能力；,
2、具有多种单一的限制酶酶切位点；,具有与受体细胞相适应的复制位点或整合位点；,基本概念：,2）存在于细菌、真菌、蓝藻、酵母等细胞中。,（二）质粒(plasmid),1）是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制、并被稳定遗传的核酸分子。,The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell,plasmid DNA,Genomic DNA,4）绝大多数的天然DNA质粒具有共价、闭合、环状的双链结构(
3、covalently closed circular DNA, cccDNA)，以超螺旋形式存在。,3）绝大多数质粒是DNA型的；,酵母的杀伤质粒(killer plasmid)是RNA。,7）最大装载量：15 kb（5%）。,5）分子大小：1-300 kb；,质粒不是单纯的寄生，携带的遗传信息赋予细菌特定的遗传性状，如抗生素抗性基因Ampr。,质粒与宿主细胞的关系：,质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主细胞中。,质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的帮助，才能完成自身的复制、转录。,质粒的基本特征：,自主复制性,不相容性,可转移性,携带特殊的遗传标记,1、自主复制性,质
4、粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统，进行自主复制。,严紧型质粒,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为：,松弛型质粒,1-3拷贝/cell，复制受细胞核控制，伴随染色体DNA复制而复制。,如：pSC101、p15A。,1）严紧型质粒(stringent plasmid)：,加入氯霉素（终浓度10-170g/ml）抑制细菌蛋白质合成后，可达3000拷贝/cell 。,2）松弛型质粒(relaxed plasmid)：,如：pMB1、ColE1。,10-200拷贝/cell，复制不受细胞核控制，染色体DNA复制停止时，仍可进行复制。,
5、2、不相容性(incompatibility),指任何两种含相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中。,分子机制：,两种含不同复制子结构的不同质粒，在复制时受各自的拷贝数控制系统调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，经若干复制周期和细胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞内。,两种含相似复制子结构的不同质粒，在复制时受同一拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。,不相容性的质粒组成不相容性群，如：,ColE1、pMB1有相似复制子结构，彼此不相容；,pSC101、F、RP4有相似复制子结构，彼此不相容；,p15A及其衍生质粒有相似
6、复制子结构，彼此不相容。,3、可转移性,接合型质粒(conjunctive plasmid),非接合型质粒(nonconjunctive plasmid),除带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。,1）接合型质粒：,能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞，如F质粒。,符合基因工程的安全要求。,2）非接合型质粒：,不能在天然条件下独立地发生接合作用，如ColE1质粒。,虽带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。,值得注意的是，某些非接合型质粒（如ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 b
7、om和mob基因决定。,4、携带特殊的遗传标记,这些标记基因对重组DNA筛选有重要意义。,野生型质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，使寄主产生正常生长非必需的附加性状。,抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,抗生素、细菌毒素、有机碱,质粒的空间构型：,共价、闭合、环状DNA(cccDNA) 超螺旋(super coil DNA, scDNA),开环DNA(open circular DNA, ocDNA) 一条链上有一至数个缺口,线形DNA(linear DNA, L-DNA),质粒空间构型与电泳速率：,质粒的分类,1、按功能：,F质粒(fertility factor),R质粒(r
8、esistance factor),Col质粒(coliconogenic factor),1）F质粒：,性质粒，决定细菌性别，能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞。,R质粒：,Col质粒：,大肠杆菌素质粒，带有控制大肠杆菌素合成的基因，合成大肠杆菌素，杀死不含Col质粒的亲缘细菌。,接合型质粒,2、按转移方式：,非接合型质粒,3、按复制机理：,接合型质粒分子量大，一般属严紧型。,非接合型质粒分子量小，一般属松弛型。,4、按分子量大小：, 15kb，多为接合型质粒；, 15kb，多为非接合型质粒。,质粒的构建,分子量大；,野生型质粒的特性提供了以其为基础、人工构建载体分子的可能。,拷
9、贝数低；,单一酶切位点少；,遗传标记不理想。,如：天然质粒pSC101分子量9.09kb，只有1个EcoR I切点充当克隆位点，筛选标志只有Tetr。,可通过插入失活筛选，但免疫筛选E1的操作非常麻烦。,ColE1的筛选标志是大肠杆菌素E1，唯一的克隆位点EcoR I正好位于这个基因内部。,大于20kb的质粒很难导入受体细胞，且极不稳定。,质粒的改造与构建：,尽量缩小质粒的相对分子量，提高外源DNA的装载量。,1）删除不必要的DNA区域，,灭活对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数。,2）灭活某些编码基因,灭活促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA重
10、组实验的安全性。,最好有两种选择标记基因，并且在选择标记基因区内有合适的克隆位点。,3）加入选择标记基因：,当外源DNA片段插入克隆位点后，标记基因失活，成为选择克隆子的依据。,氨苄青霉素抗性（ampicillin, Ampr） 卡那霉素抗性（kanamycin, Kanr） 四环素抗性（tetracycline, Tetr） 链霉素抗性（streptomycin, Strr） 氯霉素抗性（chloromycetin, Chlr）,常用的选择标记：,3）在选择标记基因内，引入人工合成的多种限制酶连续酶切位点的DNA短序列，即多克隆位点(multiple cloning sites, MCS)，
11、也称多酶接头(polylinker)。,同时删除重复的酶切位点，使其单一化。,4）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。,实验室用质粒多以少数几个野生型质粒为基础构建：,pSC101：8.8kb，拷贝数5，四环素抗性基因Tetr。,ColE1：6.5kb，拷贝数20-30（氯霉素诱导可达1000-3000），大肠杆菌素基因E1。,RSF2124：ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性基因Ampr。,1、高拷贝质粒：,1）含有氯霉素可扩增的松弛型复制子结构，如ColE1、pMB1派生质粒、pBR系列；,用于克隆和扩增外源基因。,2）复制子经人工诱变，解除对质粒拷贝数的负控制作用
12、，使质粒在每个细胞中达数千拷贝。,如：pBR322：,ori-ColE1 Tetr-pSC101 Ampr-pSP2124,2、低拷贝质粒：,某些毒性基因的表达产物过多时，会严重影响宿主菌的正常代谢活动、导致宿主菌死亡，就需要低拷贝载体。,如pLG338/339、pHSG415等pSC101派生质粒，拷贝数10，用于表达某些毒性基因。,3、温敏质粒：,即温度敏感型复制控制质粒，在不同温度 下表现出拷贝数、整合等不同性质。,4、测序质粒：,高拷贝复制，含有多克隆位点(MCS)，便于外源DNA的克隆与扩增，在MCS两端邻近区域，有通用引物互补序列，便于测序。,如：pUC18/19、M13 mp系列
13、、pGEM-T。,如：pUC18/19：,r,BamH I,pUC18,2,686 bp,Amp,lacZ,ori,GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT,EcoR I,Sst I,Kpn I,Sma I,Xba I,Sal I,Pst I,Sph I,Hind III,ori-PBR322、Ampr-PBR322,pUC18/19正选择标记lacZ的显色原理:,底物：5-溴-4-氯-3-吲哚基-D-半乳糖苷 （X-gal）,（-互补）,5、整合质粒：,含整合酶编码基因和整合特异性位点序列，克隆在这种质粒上的外源基因进
14、入受体细胞后，能准确整合在受体细胞染色体DNA的特定位点。,便于外源基因的整合。,6、穿梭质粒(shuttle plasmid)：,如：E.coli-酵母菌、E.coli-哺乳动物细胞穿梭质粒。,克隆的外源基因可不用更换载体、直接从一种受体菌转入另一种受体菌中复制并遗传。,含有两个亲缘关系不同的复制子结构、相应的选择标记基因，能在两种不同种属的受体细胞中复制并被检测。,E.coli-Pichia.pastoris穿梭质粒,E.coli-HEK293穿梭质粒,7、表达质粒：,在多克隆位点的上、下游，分别装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化元件，使外源基因能在受体细胞中高效表达、便于下游纯化。,
15、pGEM-3Z：,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体RNA聚合酶识别，相应的受体菌需表达噬菌体RNA聚合酶，如BL21(表达T7 RNA聚合酶)。,MCS,lacZ,PT7,ori,Ampr,PSP6,pET-3a：,pET-28a：,只有含启动子或终止子的外源DNA插入载体的合适位点，报告基因才能表达，表达量的高低直接反映表达调控元件的强弱。,8、探针质粒：,用于筛选表达调控元件，如启动子、终止子。,通常装有一个可定量检测表达程度的报告基因（如抗生素抗性基因），但缺少相应的启动子或终止子，因此本身不能表达报告基因。,质粒DNA的分离纯化,氯化铯密度梯度离心法,碱裂解法,沸水浴法,氯化铯
16、密度梯度离心法,沸水浴法,碱裂解法,氯化铯密度梯度离心法,质粒纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；,碱裂解法,质粒纯度低、快速、操作简便；,沸水浴法,质粒纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间。,（三）噬菌体或病毒DNA,噬菌体(bacteriophage)或病毒(virus)是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定条件下这两种状态会相互转化。,噬菌体吸附在E.coli上,噬菌体释放、菌体裂解,T4噬菌体,The DNA is about 3,500 times longer than the viral parti
17、cle.,The electron micrograph of the single linear DNA molecule of bacteriophage T2(about 182,000 bp);,可使外源基因高效导入受体细胞。,可使外源基因在受体细胞中高效扩增。,噬菌体或病毒DNA能被开发为基因工程载体的原因：,E.coli的噬菌体DNA,cos位点对包装至关重要。,-DNA两端各有12个核苷酸组成的5突出粘性末端(cohensive-end)，,二者的核苷酸序列互补，进入宿主细胞后，粘性末端连接成环状DNA分子，此末端称为cos位点(cohensive-end site)。,5 TC
18、CAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,溶菌周期,噬菌体的生活周期,溶源周期,烈性噬菌体(virulent phage)只有溶菌周期。,温和噬菌体(temperate phage)既有溶源周期，又有溶菌周期。,1、溶菌周期：,2、溶源周期：,经过若干世代后，才从细菌染色体上脱离下来，复制、合成噬菌体蛋白，组装成新的噬菌体，导致菌体细胞裂解。,噬菌体感染E.coli后，除能裂解细胞（溶菌状态）外，还能将其DNA整合到宿主细胞染色体DNA上，而不产生子代噬菌体颗粒，即溶源状态。,整合由-DNA上cI和int基因的产物激活，这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。,在
19、宿主生理状态好，即营养条件适合、菌体代谢旺盛的情况下，cI基因关闭，进入溶菌状态；在宿主生理状态差的情况下，cI基因开放，进入溶源状态。,DNA重组技术需噬菌体进入 状态。,可根据需要，改变-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶源状态。,溶菌,感染早期：双链进行型复制。,-DNA的复制：,-DNA载体的构建,野生型噬菌体能包装原-DNA长度的75-105%（37-51kb），本身长度为48.5kb， 只有当插入的外源DNA片段2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。,缩短野生型-DNA长度，可提高装载量。,1、缩短长度：,插入型载体 取代型载体,野生型-DNA上约4
20、0-50%的片段是复制和裂解所非必需的。,插入型载体(insertion vectors)：,取代型载体(substitution vectors)：,取代型载体的2个MCS区以反向重复形式位于-DNA非必需区的两端，通过酶切，可将中间的非必需区切下来，与用相同酶酶切的外源DNA置换。,2、删除重复的酶切位点,同时，为便于外源DNA的克隆，还需增加一些单一酶切位点。,野生型-DNA上有5个EcoR I、7个Hind III位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个。,甲基化酶处理、定点突变。,限制酶酶切；,3、加装选择标记,野生型l-DNA上缺少合适的选择标记。,免疫功能类标记,颜色反应类标记,
21、免疫功能类标记：imm434,imm434编码阻止-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。,噬菌体感染细菌形成的噬菌斑,颜色反应类标记：lacZ,lacZ基因编码-半乳糖苷酶，在IPTG诱导下，能催化无色底物X-gal生成蓝色化合物。,4、构建琥珀型突变体,是指CAG(Gln)向UAG(stop)的突变。,琥珀型突变(sup)：,E.coli的某些菌株含特异性校正基因，其编码产物-校正tRNA能专一性纠正这一突变。,基因工程实验中使用的受体是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。,将野生型-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。,当这种-DNA进入一般E.coli后，不能合成有活性
22、的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，从而阻止有害重组体的生物污染及扩散。,重组-DNA需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。,重组-DNA的体外包装,用于体外包装的蛋白可直接从感染噬菌体的E.coli中提取，已商品化，通常为互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分缺少D组份。,-这是基于安全性而设计的。,任何一种蛋白包装液被重组-DNA污染，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。,包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组-DNA分子混合后，包装才能有效进行。,-DNA的分离纯化,将E.coli在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入-噬菌体悬浮液，37培养1hr
23、用新鲜培养基稀释，继续培养4-12hr,（噬菌体颗粒密度达1013-1014/L，E.coli完全裂解） 超速离心，沉淀噬菌体 酚抽提，释放-DNA 乙醇或异丙醇沉淀-DNA,-DNA作为载体的特点：,可在体外包装成噬菌体颗粒，高效感染E.coli；,装载容量大，最大25 kb；,筛选方便；,提取比质粒简便；,适合外源基因的克隆和扩增，但不适合其表达。,E.coli的M13单链噬菌体DNA,生物结构：,外型呈丝状；,由外壳包装蛋白和单股正链DNA组成；,基因组为单链线性DNA，长6.4 kb；,DNA上至少有10个基因，均为增殖所必需。,2,700个外壳蛋白,不裂解宿主细胞，但抑制其生长；,M
24、13噬菌体,M13的生活周期,注意：虽不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，为正常的1/2-3/4）。,M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA,+DNA,+DNA,注入E.coli,M13基因组中只有基因II和IV之间存在一段507bp的基因间隔区(intergenic region, IG区)。,该区存在M13的ori，插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力，可作为克隆区。,M13 DNA载体的构建：,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型M13 RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13 mp系列载体,lacZ,p
25、olylinker,IG,IG区内只有1个Bsu I 切点,M13mp18的多克隆位点与pUC18相同,M13 DNA载体的特点：,克隆的DNA以单链形式输出E.coli，便于测序；,M13重组子筛选简便；,最大缺陷是装载量小，仅1.5 kb。,被M13感染的受体菌生长缓慢，形成混浊斑；重组DNA越大，混浊斑的混浊度越大。,动植物病毒DNA,单链DNA病毒 双链DNA病毒 单链RNA病毒 双链RNA病毒,按基因组结构，将动植物病毒分成四类：,动植物病毒克隆载体,双链DNA病毒：如花椰菜花叶病毒(CaMV) 单链DNA病毒：如番茄金黄花叶病毒(TGMV) RNA病毒：如雀麦草花叶病毒(TMV),
26、RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间体，可作为载体进行常规的DNA重组。,常用的动物病毒载体,应用动物病毒弱毒或无毒株:,（四）考斯质粒与噬菌粒,-DNA和M13-DNA载体的最大装载量分别为25kb和1.5kb，但很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段。,考斯质粒和噬菌粒的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。,-构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。,在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。,将噬菌体DNA包装有关序列与质粒组装在一起，既能缩短载体长度、提高装载量，又能保证重组DNA在体外仍被包装成有感染性的颗粒。,由于考斯质粒和噬
27、菌粒不携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。,考斯质粒（Cosmid）,cos,pHC79,6.4 kb,Tetr,包装相关序列,ori,Ampr,Pst I,BamH I,Sal I,1978年， B.Hohn J.Collins 发明构建,考斯质粒载体的特点：,能像-DNA那样进行体外包装，并高效转染E.coli；,装载量大（45 kb）；,能像质粒那样在E.coli中自主复制；,制备与质粒相同，重组操作简便，筛选容易；,与-DNA不同：不能体内包装，不裂解E.coli。,Cosmid克隆的过程,用CIP去除线性载体的5-P，可防止载体自连。,?,噬菌粒（phag
28、emid）,是一类人工构建的含单链噬菌体包装序列、复制子和质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型载体。,噬菌粒的特点：,能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染E.coli；,装载量比M13mp系列大得多（10 kb）；,能像质粒那样在E.coli中自主复制；,重组操作简便，筛选容易。,通过克隆双链DNA，能获得同等长度的单一单链DNA；,重要的噬菌粒载体,pUC118/119 = pUC18/19的ori、Ampr、lacZ、MCS + M13-IG、ori,pUC118/119：,1）双链质粒复制模式,2）单链噬菌体滚环复制模式,辅助噬菌体：,3）噬菌粒载体的包装,高效复制的噬菌粒单链
29、DNA被包装成噬菌体颗粒，被挤出宿主细胞外。,表示M13辅助噬菌体DNA,人工染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析需克隆数百甚至上千kb DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量远不能满足需要。,细菌人工染色体 酵母人工染色体,将细菌接合因子或酵母染色体的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即构成人工染色体载体(artificial chromosome)。,当大片段外源DNA克隆在人工染色体载体上，便形成重组人工染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定复制并遗传。,细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BAC）,1992年
30、，H.Shizuya等在E.coli性因子-F质粒的基础上构建的，装载量50-300kb；,BAC在E.coli受体菌中只能维持单一拷贝。,装载量大，为300 kb；,BAC的特点：,单拷贝复制；,可以像提取质粒一样直接提取克隆的DNA。,在细菌细胞中扩增；,CMR：氯霉素抗性基因；,parA、parB：控制拷贝数；,oriS、repE：复制起点，控制质粒单向复制；,oriS、repE、parA、parB来自性因子；,Not I：用于切下外源DNA。,Hind III和BamH I：克隆位点；,BAC的组成：,BAC主要适用于：,克隆大型基因簇（gene cluster）；,构建动植物基因文库
31、（gene library or gene bank）。,酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome, YAC）,1983年，A.W.Murray形成基础理论； 1987年，D.T.Burke构建。,按染色体结构构建；,在酵母细胞中扩增。,装载量大，为350-400kb；,染色体复制和遗传的三个基本组件：,DNA复制起始点（ori） 着丝粒（centromere） 两个端粒（telomeres）,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的复制起点ARS 酵母染色体的着丝粒CEN4 酵母染色体的端粒TEL 酵母筛选标记TRP1 酵母筛选标记URA3 E.coli的复制
32、起点ori E.coli的选择标记Ampr,CEN4,pYAC4,EcoR I,URA3,TEL,BamH I,TEL,ori,Ampr,TRP1,ARS1,TRP1：色氨酸生物合成基因 URA3：尿嘧啶生物合成基因,YAC载体的使用：,pYAC4,CEN,EcoR I,URA,TEL,BamH I,TEL,ori,Ampr,TRP,ARS,EcoR I,EcoR I,EcoR I,BamH I,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,几种载体的最大装载量：,15 kb 25 kb 45 kb 300 kb 400 kb,plasmid -DNA Cosmid BAC YAC,构建其cDNA文库： 构建其基因组文库：,构建动、植物和人类大型基因组文库：,绝大多数真核生物mRNA 10 kb：,载体常选-DNA、Cosmid；,载体选plasmid；,载体选BAC或YAC。,