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1、综合化学实验配位化学和生物无机化学部分,切割DNA的金属配合物,指导教师：毛宗万 黄华珍 ,中山大学化学与化学工程学院 2009年10月,http:/ 功能型甘氨酸铜配合物的合成和表征 模板合成 IR光谱表征 自由基的UV光谱检测 实验4 功能型甘氨酸铜配合物对质粒DNA的切割 琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像 总学时：15 学时 地点：丰盛堂218室,实验内容, 超螺旋DNA 缺刻型DNA 线型DNA,自由基机理 自由基进攻糖环或碱基，导致氧化破坏,酯水解机理 亲核试剂进攻磷原子，发生亲核取代反应,酯水解机理优于自由基机理,DNA结构及其断裂方式,配合物与未受损的DNA表面结合并诱导其断裂 进一步
2、在新的断裂处结合 断裂反应 互补链的断裂,DNA的自由基断裂,实验背景模拟博莱霉素,在天然物质中，由5 个氨基酸、2 个六碳糖和1 个氨基侧链构成的博来霉素（bleomycin）可导致DNA链的断裂,从而作为一族广谱抗菌抗肿瘤药物。,导致DNA链的断裂原因是由于博来霉素分子的一部分是铁或铜的配合物，这类配合物能够产生导致DNA链断裂的自由基。,CuP-3A的配位结构示意图,博莱霉素的活性中心,Pamatong, F. V.; Detmer. C. A., III; Bocarsly, J. R.; J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5339. Detmer. C. A
3、., III; Pamatong, F. V.; Bocarsly, J. R.; Inorg. Chem., 1996, 21, 6292.,博莱霉素的模型化合物,Cu2+ + e- = Cu+ Cu+ + H2O2 = Cu2+ + OH- + OH,氨基酸铜化合物的合成路线,模板反应的化学机理,化合物1的红外光谱,(COO-),(COO-),(NO2),(NO2),化合物2的红外光谱,(COO-),(COO-),(NH2),氢氧自由基的形成和UV光谱检测,由于罗丹明B可与HO迅速反应，并在553nm有强吸收，因此我们可以利用此反应采用分光光度法检验HO的生成。,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶
4、电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等,凝胶浓度选择琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,电泳缓冲液,常用三种缓冲液 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸(TPE) TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 E
5、DTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解,核酸电泳的指示剂,指示剂：溴酚兰、二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段 二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当,核酸电泳的染色剂溴化乙锭,一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng 溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放
6、入蒸馏水浸泡30min后再观察,ethidium bromide，EB,电泳实验装置,电泳仪（普通） 电泳槽（水平平板） 灌胶模具等,电泳实验方法,洗净电泳槽，架好梳子 配制琼脂糖凝胶及倒胶 上样与通电 结果观察,配制琼脂糖凝胶及倒胶,0.5TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至60(需要时可加入EB)，倒入电泳槽中，待凝固。 向电泳槽中倒入0.5 TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去）,上样与通电,在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内 接通电源，一般红色为正极黑色为负极，
7、切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为1 5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算） 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般 电泳条件为：电压 90V，时间 40min。,结果观察和记录,紫外仪上观察电泳带及其位置 拍照 进一步使用软件对光密度进行分析,DNA断裂的凝胶电泳图, 超螺旋DNA 缺刻型DNA 线型DNA,合成实验要点,检查回流装置是否保持干燥 硝酸铜在称量前用滤纸吸干固体表面潮解的溶液 合成实验中前半个小时注意观察反应混合物的颜色变化，亮蓝色或紫蓝色为反应正常 实验中化合物合成与DNA断裂实验需交叉进行， DNA断裂所需的配合物由准备室提供 若硝基还
8、原使用了较多溶剂，需使用旋转蒸发器除去多余溶剂 凝胶电泳照相需戴手套,模板合成大环化合物的合成方法（218室） 旋转蒸发器除去多余溶剂（218室） 红外光谱化合物结构表征 （201室） 紫外可见光谱跟踪罗丹明B与氢氧自由基的反应（204室） 凝胶电泳切割DNA （210室） 凝胶成像分析检测DNA断裂状况（210室）,实验技术和方法,实验要求,写好预习报告（查阅药品及溶剂的性质、羧基和硝基的IR特征峰值、光谱技术原理及思考题预习等） 实验中做好实验记录及相关计算（包括实验现象、产品重量、产率等） 做好每一次测试，并打印结果 实验结束时提交最终产品和测试图谱供检查 对实验结果作简要讨论 下一次实验提交本次实验报告 遵守实验规则，严禁违规操作，做好清洁值日,（配位化学、生物无机化学、生物技术） V. V. Gerbeleu, V. B. Arion, J. Burgess, “Template synthesis of macrocyclic compounds”, WILEY-VCH verlag GmbH, 1999. 计亮年，黄锦汪、莫庭焕等编著，生物无机化学（第二版），中山大学出版社，2001。 杨频，高飞编著，生物无机化学，科学出版社，2002。 F.奥斯伯， R.布伦特， R.E.金斯顿 等， 精编分子生物学实验指南，1998年6月第1版。,参考书,