第十章蛋白质和氨基酸的测定.ppt

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1、第十章 蛋白质和氨基酸的测定,4,主 要 内 容,氨基酸的分离测定,6,1、蛋白质的测定原理、测定方法、注意事项。 2、氨基酸的测定原理、测定方法、注意事项。 3、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理,1、蛋白质的性质和测定意义； 2、凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法摘要； 3、熟悉凯氏定氮仪的工作原理和使用方法。,2.重点,1、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。 2、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理。,3.难点,3.,1.基本知识点,学 习 目 标,第一节 概述,一、蛋白质的组成 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它由20多种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有复杂的空间结构。它主要含的

2、元素是C 、H、O、N、S、P另外还有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。而含N是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。 二、氨基酸 pro是由氨基酸组成的高分子化合物，目前各种氨基酸已达175种以上，但是构成pro的氨基酸主要有20种。,赖氨酸,天冬氨酸,缬氨酸,天冬酰胺,丝氨酸,Pro的基本组成单位是氨基酸,那什么是氨基酸呢？,几种常见的氨基酸,几种常见的氨基酸,这些氨基酸结构上有什么共同点？,羧基和氨基连接在同一个碳原子上,蛋白质的基石物质：-氨基酸,氨基酸的缩合,肽键,二肽、多肽等,误食重金属盐，可以喝大量牛奶进行紧急处理，WHY? 鸡蛋水煮会发生什么样变化？ 医用酒精可以消毒，福

3、尔马林可以保存动物标本，WHY？,问：蛋白质具有什么样的性质呢？,三、蛋白质的性质,盐析 变性,小 结,蛋白质的主要组成元素？ 天然蛋白质的分子量：天然高分子有机化合物，分子量几万到几十万； 哪些物质中富含蛋白质呢？,Pro是食品的重要组成成分，也是生命的基础。人体11%-13%的总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。测定食品中的蛋白质含量，对合理调配膳食，保证不同人群的营养需求，掌握食品的营养价值，合理开发利用食品资源，控制食品加工中食品的品质、质量都具有重要的意义。 Pro是食品的最重要质量指标。食品营养价值的高低，主要看蛋白质的高低。,四、蛋白质测定的意义,除

4、了保证食品的营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。 蛋白质是微生物发酵中所必需的重要氮源之一。 Eg. 发酵原料中蛋白质含量的高低对发酵产品的质量影响很大。 啤酒生产要选用蛋白质含量较低的大麦等原料，因啤酒酿造中，原料（大麦芽）中蛋白质含量过高，可造成啤酒浑浊、高级醇含量偏高。 但对酱和酱油等发酵调味品来讲，则需要选用蛋白质含量较高的原料； 至于活性干酵母，含氮量则是评价其成品质量的一个重要指标，主要是判定活性酵母菌的数量。,四、蛋白质测定的意义,五、蛋白质的测定方法,蛋白质的测定方法分两大类： 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量； 另一类

5、是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。,具体测定方法： 凯氏定氮法：最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法 国外：红外分析仪,氨基酸总量酸碱滴定法测定； 各种氨基酸的分离与定量色谱技术。 有多种氨基酸分析仪。,第二节 蛋白质的定性测定 （p116),一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。（5 种染料） 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）,第三节 蛋白质的定量测定, 总蛋白质含量； 氨基酸组成； 混合物中的特定蛋白质的含量； 蛋白质分离纯化过程中的蛋白

6、质含量； 非蛋白氮； 蛋白质的营养价值(消化率、蛋白质功效比或氮平衡),蛋白质分析的重要性,一、含量及测定意义,食品中蛋白质的含量,食品中蛋白质的含量,测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。,二、蛋白质系数,不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其

7、制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。,一般手册上列出了一部分换称等数，用时可查。,三、蛋白质含量测定常用的方法,凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。 凯氏定氮法是目前普遍采用的测定有机N总量较为准确、方便的方法之一，适用于所有食品，所以国内外应用较为广泛。是经典的分析方法之一，也是GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定第一法。,三、蛋白质含量测定常用的方法,凯氏定氮法是将蛋白质消化，测定其总N量，再换算成为蛋白质含量。食品中的含N物质，除蛋白质中的氮以外，还包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮等少量的

8、非蛋白质含N物质，所以该法测定的蛋白质含量应称为粗蛋白质。 对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的pro的元素组成百分比。,（一）、凯氏定氮法,凯氏定氮法有常量法、微量法及改良法，其原理基本相同，只是所使用的样品数量和仪器不同。而改良的常量法主要是催化剂的种类、硫酸和盐类添加量不同，一般采用硫酸铜、二氧化钛或硒、汞等物质代替硫酸铜。 有些样品中含有难以分解的含N化合物，如：蛋白质中含有色氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、脯氨酸等，单纯以硫酸铜作催化剂，18小时或更长时间也难以分解，单独用汞化合物，在短时间内即可，但它有毒性。,凯氏定氮法,常量分析（macro analys

9、is）：对0.1g以上的试样进行的分析。 半微量分析（semimicro analysis）：对10mg100 mg的试样进行的分析。 GB/T 5413.1-1997 婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定就是半微量凯氏定氮法 微量分析（micro analysis）：对1mg110 mg的试样进行的分析。 超微量分析（ultramicro analysis）：对1mg以下的试样进行的分析。 痕量分析（trace analysis）：对待测组分的质量分数小于0.01%的分析。 超痕量分析（ultratrace analysis）：对待测组分的质量分数小于0.0001%的分析。 GB/T 14666

10、-2003分析化学术语,（1）常量凯氏定氮法,原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再用标准酸滴定，根据标准酸消耗量可计算出样品中蛋白质含量。,凯氏烧瓶500 mL或250 mL 龙科A凯氏定氮仪 扭力天平 分析天平 5mL移液管 温度可以控制的电炉 小漏斗 滴定管 250 mL锥形瓶 玻璃珠,仪 器,（GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定第一法）,仪 器,硫酸铜 (CuSO45H2O) 硫酸钾 硫酸 (密度为1.8419g/L) 硼酸溶液 (20g

11、/L) 氢氧化钠溶液 (400g/L) 盐酸标准滴定溶液c(HCl)=0.0500 mol/L 或硫酸标准滴定溶液c(1/2H2SO4)=0.0500 mol/L 混合指示液：1份甲基红乙醇溶液 (1g/L) 与5份溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L) ，临用时混合。(也可用2份甲基红乙醇溶液(1g/L)与1份次甲基蓝乙醇溶液(1g/L)临用时混合)。,试 剂,（GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定第一法）,（GB/T 601-2002 化学试剂 标准滴定溶液的制备 1、配制 按下表的规定量取盐酸，注入1000 mL水中，摇匀。 常用酸碱浓度表(市售商品) （GB/T5009.1-200

12、3 食品卫生检验方法 理化部分 总则）,盐酸标准滴定溶液配制与标定 c(HCl)=0.0500 mol/L,2、标定 按下表的规定称取于270300高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳酸钠，溶于50 mL水中，加10滴溴甲酚绿-甲基红指示液，用配制好的盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2 min，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。 说明： 称量工作基准试剂的质量的数值小于等于0.5 g时，按精确至0.01 mg称量;数值大于0.5 g时，按精确至0.1 mg称量。 在标定和使用标准滴定溶液时，滴定速度一般应保持在68 mL/min。,制备标准滴定溶液的浓度值应在规定浓度值

13、的5%范围以内。 标准滴定溶液的浓度小于等于0.02 mol/L时，应于临用前将浓度高的标准滴定溶液用煮沸并冷却的水稀释，必要时重新标定。 除另有规定外，标准滴定溶液在常温1525下保存时间一般不超过两个月。当溶液出现浑浊、沉淀、颜色变化等现象时，应重新制备。 贮存标准滴定溶液的容器，其材料不应与溶液起理化作用，壁厚最薄处不小于0.5 mm。,（GB/T 601-2002 化学试剂 标准滴定溶液的制备） 1、配制 按下表的规定量取硫酸，缓缓往入1000 mL水中，冷却，摇匀。 2、标定 按下表的规定称取于270300 高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳酸钠，溶于50 mL水中，加10滴溴甲

14、酚绿-甲基红指示液，用配制好的硫酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2 min，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。,硫酸标准滴定溶液 c(1/2H2SO4)=0.0500 mol/L,溴甲酚绿甲基红指示液,（GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定第一法） （GB/T 603-2002 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备） 溶液I：称取0.1g 溴甲酚绿，溶于乙醇(95%)，用乙醇(95%)稀释至100 mL。 溶液：称取0.2 g甲基红，溶于乙醇(95%)，用乙醇(95%)稀释至100 mL。 取30 mL溶液I、10 mL溶液，混匀。,凯氏定氮法,步骤,总反

15、应式： 2NH2（CH2）2COOH + 13H2SO4 （NH4）2SO4 + 6CO2 + 12SO2 + 16H2O （一定要用浓硫酸-98%）,样品消化, 加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高至400以上。也可加入 硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。,为缩短消化时间,硫酸铜 作为催化剂同时作为消化终点指示剂。也可加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。 氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。,样品消化,要注意防止爆沸,消化液 + 40

16、%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。 2NaOH +（NH4）2SO4 2NH3 + Na2SO4 + H2O,蒸 馏,蒸馏: 一：加入氢氧化钠溶液要过量; 二：要防止样液中氨气逸出。, 用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。 指示剂 红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸）,滴定,吸收与滴定, 用过量的 H2SO4 或 HCl标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。,凯氏定氮法分析步骤再次说明,（一）试样处理 1、称样 (约相当氮30 40 mg) （1）固体试样：0.202.00 g （2）半固体

17、试样：2.005.00 g （3）液体试样：10.0025.00 mL 2、消化准备 将试样移入洗净、烘干、编号的100 mL或500 mL的凯氏烧瓶内 ，加入0.2 g硫酸铜，6 g硫酸钾及20 mL硫酸，加入2粒3粒玻璃珠，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45角斜支于有小孔的石棉网上。,GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定第一法）,3、消化 将准备好的凯氏烧瓶以45斜放于温控电炉上（先垫上石棉网），开始用微火小心加热，（小心瓶内泡沫冲出而影响结果！），待内容物全部炭化,泡沫完全停止，瓶内有白烟冒出后，升至中温，白烟散尽后升至高温，加强火力,并保持瓶内液体微沸,（为加快消化速度

18、,可分数次加入10 mL 30%过氧化氢溶液，但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入！）,经常转动烧瓶，观察瓶内溶液颜色的变化情况，当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.51h。然后取下并使之冷却。,消 化,（若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，进行摇动或待瓶中内容物冷却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下，继续消化至透明为止）。,4、定容 将消化好并冷却至室温的样品消化液加入20 mL蒸馏水摇匀放冷，小心转移到100 mL容量瓶中，再用蒸馏水少量多次洗涤凯氏烧瓶，并将洗液一并转入容量瓶中，直至烧瓶洗至中性，表明铵盐无损地移入容量瓶中，充分摇匀后，静置至室温，加水至刻度线定容，混匀备用。 同样条件

19、下做一试剂空白试验。,消 化,蒸 馏,（二）蒸馏 1、水蒸汽发生器的准备：按要求安装好定氮装置，保证管路密闭不漏气。于水蒸气发生瓶内装水至2/3处，加甲基红指示剂3滴及35 mL硫酸，以保持水呈酸性（防止水中含有N，加硫酸使成为(NH4)2SO4形式固定下来，蒸馏中不会被蒸发），开通电源加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。,蒸 馏,2、清洗凯氏定氮仪：打开进气口，关闭废液出口，接通冷凝水，空蒸5 10 min，冲冼定N仪、样杯、碱杯和内室。分别关闭进气口（注意不要同时关闭所有进气口！），使废液自动倒吸于定氮仪外室，再由样杯加入少量水，冲冼再次，当废液全部吸入外室后，再放排液口，并使其敞开。 3、吸收液

20、准备：在250 mL锥形瓶中加入10 mL (20 g/L)硼酸溶液和13滴混合指示剂，放置冷凝器的下端，并使冷凝管下端插入液面下。,4、蒸馏准备：准确吸取10mL试样处理液，由样杯（小漏斗）流入定氮仪内室（反应室），并用10 mL水冲洗样杯（小漏斗）使流入定氮仪内室（反应室内）但内室中溶液总体积不超过内室的2/3 (约50 mL)，塞紧棒状玻塞，加水至杯口12cm，以防漏气，关闭排液口，迅速由碱杯缓缓加入10 mL氢氧化钠溶液(400 g/L)，夹紧螺旋夹，通入蒸汽开始蒸馏。,蒸 馏,5、蒸馏：关闭排液口，蒸汽进入反应室（内室），NH3通过冷凝管进入接收瓶被硼酸吸收，蒸馏5 min，移开接收

21、瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1 min，然后，用少量水冲冼冷凝管下端外部，洗液一并聚集于硼酸溶液中。 6、收尾：关闭进气口，停止送气，废液将自动倒吸入外室，待倒吸完全时，将样杯中的蒸馏水分数次放入，冲冼内室，待洗液全部吸入外室后，再打开排液口，放净废液。 按上述步骤，换下一试样蒸馏。同时准确吸取10 mL试剂空白消化液作空白试验。,蒸 馏,滴 定,取下接收瓶，以硫酸或盐酸标准滴定溶液(0.05 mol/L)滴定至灰色或蓝紫色为终点。,结果计算,W蛋白质含量； c盐酸标准液的浓度，mol/L； V1滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； m样品

22、质量，g； M-1/2 N2的摩尔质量，14.01 g/mol; F蛋白质系数.,. 适用范围,此法用于各类食品中蛋白质含量的测定，是国家标准分析方法。,.说明,所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制; 消化时不要用强火，应保持缓和沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失; 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全;,样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度; 当样品消化液不易澄清透明

23、时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢 23 mL 后再继续加热消化;,若取样量较大，如干试样超过5 g可按每克试样5 mL的比例增加硫酸用量; 般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以消化的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色; 蒸馏装置不能漏气;,蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量; 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。,（二）、 微量凯氏定氮法,1、原理及适用范围同前 2、

24、与常量法不同点： 加入硼酸量由 50 mL 10 mL, 滴定用盐酸浓度由 0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。,10-2,10-2,（三）、 全自动凯氏定氮法,1、原理及适用范围同前 2、特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。,操 作 视 频,微量凯氏定氮法： http:/ 凯氏定氮法 http:/ （7 m 54 s),传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大

25、仪器，但费时，有环境污染。 新开发的：,（四）、双缩脲法,脲（尿素）NH2-CO-NH2加热至150160 时，两分子缩合成双缩脲。,双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键“CO-NH-”与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560 nm）,NH2-CO-NH-CO-NH2 + NH3,原 理,2. 方法特点及应用范围 灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定

26、。 3.主要仪器：分光光度计，离心机（4000 r/min） 4. 试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液 (2) 四氯化碳,（四）、双缩脲法,5操作方法： 采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。 6. 说明： 测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化。,（四）、双缩脲法,1原理： 利用蛋白质的特有基团,对紫外光有吸收作用，在280 nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。,（五）、紫外吸收法,2适用范围： 常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。 3主要仪器： 紫外分光光度计； 离心机：3000-5000 r/min 4操作：用凯氏法测定标样做标准曲线

27、。,第五节 氨基酸的定性测定,第六节 氨基酸定量测定,1. 原理： 氨基酸本身有碱性 （-NH2-），又有酸性（-COOH），成中性内盐，加入甲醛溶液后，与-NH2-结合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOH基。 2特点： 适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。适于食品中游离氨基酸的测定。,一氨基酸的一般定量测定 （一）甲醛滴定法,3双指示剂： 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液； 0.1%中性红50%乙醇溶液； 0.1 mol/L 氢氧化钠标液。,（一）甲醛滴定法,（一）甲醛滴定法,4. 操 作,（二）

28、茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。,二个别氨基酸的定量测定 8种氨基酸的定量测定方法：P147,一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。,第七节 氨基酸的分离与测定,一薄层色谱法：薄层层析法（TLC 法）,取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交

29、换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。,（一）原理,Rf = a/b,样点,点样原点,（二）优、缺点,（三）操作方法：P155, 薄层板制备 样品液制备 点样：距薄板底端2 cm处，用针画一标记作为原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时展开，点与点之间间隔12 cm。 a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意要等一个点干了再点另一个点。 b.用一小直径3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到板子上先挖好一个小洞穴。,（三）操作方法, 展

30、开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一定角度1030，下端浸入展开剂1 cm，千万别让溶剂浸过了样点。到离顶端一部分，取出样板、晾干、显色。,a.展开剂的有关情况：主要是低沸点的23种有机溶剂组成的溶剂系统，分离效果主要决定于展开剂的选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定的，吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择。,b.展开剂的选择方法： .微量圆环法; .用小载波片试验，微量展开剂展开5 cm; .图解法： 样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。 样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。 有机溶剂极性由小到大为： 石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、

31、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。, 显色： a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。 b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。 c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。 （涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中）,定性：在同一块板上，同等条件下操作，被测样与标准样同时展开、显色，同 Rf 值或查手册找相同的Rf值。 定量： a.目视定量法：以标准斑点对照，相当于样品斑点中含量ug数。 b.斑点面积定量法。 c.将样点取下来，定容，离心，比色。 d.利用薄层色谱扫描仪： 例：日本岛津 CS910型双波长薄层色谱扫描仪,离心薄层色谱仪： 1. LBG1型离心薄层色谱仪，北京产； 2. 7924型离心薄层色谱仪，美国Harrison 公司研制； 3. CLC5型离心制备液体色谱仪（日本日立公司，带紫外检测器、记录器和自动收集器，制备量可达10 g）。 二氨基酸自动分析仪法 三气相色谱法 四高效液相色谱法,全自动氨基酸分析仪,10-3,第十章 重 点,凯氏定氮法原理、分步、测定方法。 双缩脲法测定原理。 氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。 TLC法原理、方法，Rf值的作用及计算方法。,