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1、作业规范：,Word文档 文件名：名字+阿拉伯数字 以邮件发送至 独立完成，禁止抄袭,植物病毒 是一类比较原始的、结构简单的、能够自我复制和严格细胞内寄生的非细胞生物。由核酸和蛋白衣壳组成，是分子寄生物。,简要回顾,按它们寄主的不同，病毒分为: 寄生植物的植物病毒(PIant virus)、 寄生动物的动物病毒(Animal virus) 寄生细菌的噬菌体(Phage)等。,病原,形态结构 组成成分 基因组结构与功能 侵染与增殖 分类与进化,症状 病理变化 寄主范围 致病与抗病,传播方式 介体种类 传毒机制,生态 流行 控制,诊断 监测 控制,第二章 植物病毒的结构,一、病毒的结构组成,1.基
2、因组核酸 2.病毒的衣壳 3.病毒内含物 4.病毒的包膜,Virus Composition,Nucleic acids and proteins,Nucleic acids: 5%-40% Proteins: 60%-95%,病毒主要由核酸和蛋白质组成。有些病毒，特别是动物病毒，还有脂质、糖类和少量其他成分。如流感病毒组成除RNA和蛋白质外，还有5%-9%的多糖、11%的磷脂和6%的胆固醇。,大部分的植物病毒的核酸为RNA，且多数只有一种结构蛋白；而动物病毒和噬菌体的核酸有许多为DNA，且大多几种不同种类的结构蛋白。,1.基因组核酸,病毒遗传信息的物质基础,(1)核酸类型和链数,病毒的核酸只
3、含一种核酸，但核酸类型和链数存在多态性，既可以是双链DNA、单链DNA，也可以是单链DNA或RNA。 大部分的DNA病毒为双链，RNA病毒为单链，但细小病毒和花椰菜花叶病毒等是单链DNA，呼肠孤病毒和双链RNA病毒的RNA都是双链的。 反转录病毒在复制过程中，其RNA反转录成DNA，因此在某些特定阶段会出现RNA和DNA两种核酸形式共同存在。,植物病毒的核酸类型： 植物病毒的核酸只有 RNA或DNA两种，按核酸的种类和其在复制过程中的功能，可分为5种类型病毒，其中3种为 RNA病毒，2种为DNA病毒。 正单链 RNA (positive single strand RNA， 十ssRNA) 病
4、毒 负单链 RNA (negative single strand RNA， - ssRNA) 病毒 双链 RNA (double strand RNA，dsRNA) 病毒 单链 DNA (ssDNA) 病毒 双链 DNA (dsDNA) 病毒,核酸的多分体现象和多分体病毒 多分体现象为植物病毒所特有，并仅存在于正单链RNA病毒（+ssRNA病毒）中。 核酸多分体病毒是指病毒的基因组分布在不同的核酸链上，分别包装在不同的病毒粒体里。这种分段的基因组被称为多组分基因组；含多组分基因组的病毒被称为多分体病毒。 根据基因组分离和侵染所必需的状况可将正单链 RNA病毒分为单分体病毒、双分体病毒和三分体
5、病毒。,三分体病毒：核酸包被在三种粒体中的病毒，如黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）和苜蓿花叶病毒(AMV)，它们均有四条核酸链，但被包装在三种或四种粒体中。,(2)核酸分子量和长度,不同病毒的核酸大小差异很大，其分子量变化范围一般在106-108Da之间。DNA病毒的分子量在1.5-200X 106之间，如痘病毒基因组线状双链DNA，分子量为1.6 X 108 ，烟草花叶病毒基因组为单链RNA，分子量为2X 106 。 病毒基因组的分子量大小反映了不同病毒基因组结构和功能的差异。 一般病毒粒体越大，核酸量越大，如疱疹病毒的DNA长达235kb，嗜肝DNA病毒长3.2kb，而类病毒长仅2
6、46-375nt。 一般双链RNA都很长，如呼肠孤病毒的双链RNA可长达几个微米。,(3)核酸占病毒干重,有包膜病毒：一般含量低，因为包膜脂质占了一定的比重。如疱疹病毒的双链DNA仅占病毒干重的6.8%，痘病毒占3%-5%；单链RNA有包膜病毒如弹状病毒占4%-5%。 无包膜病毒：一般含量较高，双链DNA病毒如腺病毒占10%-12%；单链DNA病毒如细小病毒占19%-32%；双链RNA病毒如呼肠孤病毒占15%-30%；单链RNA病毒如小RNA病毒占20%-32%。,(4)形状,电子显微镜下观察到病毒的核酸形状：RNA一般为线状，DNA一般为环状。 基因组核酸可以是完整的一条，也可以是分段的。
7、基因组核酸可以由外壳蛋白包被在一个粒体中，也可以分别由几个大小不同的粒体包被。,(5)碱基组成,由A、T或(U)、G、C四种碱基组成，但不同病毒的核酸各碱基含量差异大。伪狂犬病毒基因组的G+C含量多达72%，鸡痘病毒基因组的G+C含量只有35%。 一般地，亲缘关系近的病毒的核酸碱基组成相似，不同科属的病毒之间差异大。 G+C含量与病毒双链DNA的稳定性有关，通常G+C含量越高，Tm值也越高，双链DNA越稳定。 有些病毒含有稀有碱基，如虹彩病毒属成员的基因组约有20%的脱氧胞嘧啶为5 -甲基脱氧胞嘧啶所取代。,2.病毒的衣壳,(1)蛋白种类 (2)衣壳蛋白的功能,(1)蛋白种类,病毒的蛋白种类
8、结构蛋白：主要是衣壳蛋白(coat protein，缩写为 CP)和囊膜蛋白。 非结构蛋白：病毒核酸编码的非结构必需的蛋白，包括病毒复制需要的酶（复制酶），传播（传毒相关因子）、运动需要的功能蛋白（运动蛋白）和基因沉默抑制子（克服寄主的防御反应）等。,病毒衣壳蛋白种类,病毒衣壳或壳体(capsid)是由病毒基因组编码的衣壳蛋白亚基通过一定的方式聚集而成的。有的衣壳只由一种蛋白亚基组成，有的则由几种蛋白亚基组成。衣壳蛋白不仅具有包裹病毒基因组的作用，而且还参与了病毒的其他一些生命活动过程。,RDV基因组结构和编码蛋白： 结构蛋白（P1、P2、P3、P5、P7、P8 和 P9); 非结构蛋白（Pn
9、s4、Pns6、Pns10、Pns11、Pns12）,RDV双层病毒粒体组装过程,单分体病毒：整个遗传信息存在于一条核酸链上、包被在一种粒体中的病毒，如常见的烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、马铃薯 X病毒属(Potxvirus)和马铃薯 Y病毒属(Potyvirus).,结构蛋白与非结构蛋白,病毒基因组编码的结构蛋白，主要用于构成衣壳，但有的病毒基因组还编码另一些多肽，参与病毒复制或基因表达调控，这些称为非结构蛋白。 病毒的结构蛋白主要包括衣壳蛋白(capsid protein)、包膜蛋白(envelope protein)以及基质蛋白(matrix protein)。,几种蛋白在病
10、毒粒体上的位置,衣壳蛋白形成保护病毒基因组的壳体或外壳，包膜蛋白主要是镶嵌在包膜内或位于包膜表面的糖蛋白。在有包膜的病毒中，其衣壳蛋白与病毒基因组紧密结合，形成核糖核蛋白(ribonucleioprotein, RNP)或核壳体，而基质蛋白则可以使包膜与核衣壳联系在一起。,(2)衣壳蛋白的功能,保护病毒基因组,主要功能：保护病毒基因组免遭各种理化因子，如核酸酶、各种化学诱变剂以及环境中的各种不利因素的破坏。 乙肝病毒,决定病毒的抗原性,病毒衣壳是病毒粒体的主要抗原蛋白，由多种氨基酸组成，并有一定的电荷分布，它通过二硫键、氢键和疏水作用力形成具有一定空间构象的抗原决定簇。,抗原决定簇可以刺激宿主
11、免疫系统产生特异免疫反应。流感病毒根据其核衣壳蛋白（包括基质蛋白）抗原性的不同，可以分为甲、乙、丙型流感病毒。 SV40,决定病毒的抗原性,吸附作用,在无包膜病毒的感染过程中，其衣壳蛋白能作为吸附蛋白而与宿主细胞表面的受体蛋白相互识别、结合，从而使病毒粒体吸附于宿主细胞表面。 T4噬菌体的吸附蛋白是噬菌体尾部的尾丝蛋白。,血凝作用,有些裸露病毒的衣壳蛋白与有包膜病毒的包膜突起HA、HN一样，也具有凝集红细胞的能力，如呼肠孤病毒的外壳蛋白 1，就有凝血活性，故称为 1HA。,(3)病毒的内含物,有些病毒粒体在病毒核心还有一些病毒内含物，它们是病毒生命过程中所需的酶、核酸结合蛋白或其他化合物。 有
12、的病毒核心蛋白与核酸结合松散，如腺病毒的核蛋白V和VII，有的病毒核心蛋白与核酸结合紧密，如流感病毒核心的PB1、PB2和PA，它们还构成流感病毒的RNA聚合酶。 烟草花叶病毒的基因组连锁病毒蛋白VPg (viral protein, genome-linked)，这是一种由病毒编码的与病毒基因组RNA共价相连的特异小蛋白质，据认为该蛋白质在RNA合成中起着引物的作用。,(4)病毒包膜,许多病毒粒体衣壳外有一层包膜，如披膜病毒、正粘病毒、副粘病毒、逆转录病毒、弹状病毒、疱疹病毒等。,病毒包膜的来源,宿主细胞的细胞膜或内质网膜或高尔基体膜，它是病毒成熟时从细胞膜或内膜出芽而获得的，因此具有宿主细
13、胞膜的特性。,病毒包膜的化学组成,经电子显微镜和X光衍射分析，发现所有病毒的包膜结构大体一致，其包膜的化学组成与细胞膜类似，只是病毒包膜所含有的脂类分子的种类或数量以及镶嵌在其中的蛋白质分子与细胞膜略有不同。,病毒包膜的功能,病毒吸附：病毒包膜突起的主要功能是作为病毒吸附蛋白而起作用，它与病毒的吸附、感染密切相关。如流感病毒的HA突起，冠状病毒的S蛋白构成的突起等。,病毒包膜的功能,细胞融合活性：有些病毒包膜突起能使病毒包膜与宿主细胞膜融合或与未感染细胞之间产生融合，如披膜病毒突起中的E1蛋白具有细胞融合活性。,病毒包膜的功能,血溶活性：副流感病毒、腮腺炎病毒和麻疹病毒具有血溶活性，即溶解血红
14、细胞，这是由于它们含有突起F，因此F糖蛋白又称为血溶素(hemolysin)。,病毒包膜的功能,抗原性：病毒的包膜糖蛋白突起对病毒来说是很重要的抗原物质，这些突起可产生保护性的中和抗体。如流感病毒的HA和NA突起分别具有不同的抗原性。,二、植物病毒基因组特征及其表达,1.基因组结构：正单链RNA病毒 5端：帽子结构（保护RNA）、 Vpg (病毒复制与侵染） 3 端：tRNA结构（参与负链的合成）、polyA（稳定RNA）、无规则序列（与CP专一性识别，激活RNA复制） 以烟草花叶病毒(TMV)为例进行介绍。 TMV为SSRNA病毒，基因组核酸全长6395个核苷酸，共有5个开放阅读框架。核酸的
15、5端有帽子结构，3端有类似tRNA的结构。,126 kDa/183 kDa蛋白：RNA聚合酶 30kDa：移动蛋白（MP） 17.6kDa：除了结构功能外，还参与症状表现和病毒的长距离运输,2. 植物病毒基因组表达策略 由于真核生物体内的蛋白质合成机构仅仅识别病毒RNA上的第一个开放阅读框架(open reading frame，ORF)，同一核酸链上其它基因的表达则要借助病毒的特殊翻译策略。 现在发现十ssRNA病毒基因组在真核生物蛋白合成系统中有五种翻译策略： （1）亚基因组RNAs策略: （2）多聚蛋白策略 （3）多分体基因组策略 （4）通读蛋白(readthrough)策略 （5）核糖
16、体移码(transframe)策略,（1）亚基因组RNAs策略,由基因组3末端转录产生一到多个亚基因组(sub genomic)RNA，从各个亚基因组5端的开放阅读框架翻译出功能性蛋白，如烟草花叶病毒属。,（2）多聚蛋白策略,基因组核酸具有编码多个蛋白的能力，但是其翻译仅从单一开放阅读框架进行，产生的多聚蛋白(polyproteins)在病毒编码的蛋白酶作用下，分解为多个最终的基因翻译产物，如马铃薯Y病毒属。,病毒的基因组分装在不同的核酸链上，每条核酸链均从5端进行翻译，直接产生基因的翻译产物，如黄瓜花叶病毒属。,（3）多分体基因组策略,（4）通读蛋白(read-through)策略,基因5开
17、放阅读框架的终止密码子可能漏读(leaky)，允许一定比例的核糖体继续向下游翻译，直至下一个终止密码子，从而产生第二个更长的功能蛋白，如烟草花叶病毒属复制酶的翻译。,（5）核糖体移码(trans-frame)策略：在翻译接近开放阅读框架的终止密码子时，核糖体回读一个核苷酸(少数情况是跳过一个)，这样使终止密码子UAG分到两个三联体密码中，使翻译继续到下一个开放阅读框架，从而产生一个大蛋白。,三、植物病毒的复制和增殖,病毒生命周期的8个阶段,吸附,侵入,脱壳,复制及表达,装配,释放,成熟,植物病毒的侵染,机械微伤（fine wound） 传毒介体直接注入,Leaf Before Rubbing,
18、Leaf After Rubbing,Aphid feeding in Phloem,植物病毒的复制,植物病毒没有细胞结构，不像大多数生物那样具有复杂的繁殖器官进行有性或无性繁殖，也不像细菌那样进行裂殖生长，而是分别合成核酸和蛋白质再组装成子代病毒粒体。这种特殊的繁殖方式称为复制。,病毒侵染植物后，在活细胞内增殖后代需要两个步骤，一是病毒核酸的复制（replication），即病毒的基因传递；二是病毒基因的表达（gene expression），即病毒蛋白质合成。,植物病毒利用寄主细胞核酸复制系统及蛋白质合成系统复制其基因组和合成其专化性蛋白,大部分植物病毒的核酸复制是由RNA到RNA。病毒核
19、酸的复制需要寄主提供复制的场所（通常是在细胞质或细胞核内）、复制所需的原料和能量、部分寄主编码的酶及膜系统。病毒自身提供的主要是模板和专化的聚合酶，即复制酶。花椰菜花叶病毒编码一种依赖于RNA的DNA聚合酶，也称反转录酶。,植物病毒核酸的复制,植物病毒基因组复制及mRNA合成途径具有多样性,根据核酸种类和性质不同，植物病毒复制可分为多种类型。 以（+）RNA病毒为例，病毒的复制过程如下： （1）病毒粒体进入寄主细胞，脱壳，释放RNA； （2）RNA与核糖体结合，翻译出病毒复制酶等与复制相关的基因产物； （3）复制酶以（+）RNA为模板合成（-）RNA链，并形成双链复制型； （4）从复制型产生子
20、代（+）RNA链； （5）以病毒RNA为模板合成外壳蛋白； （6）外壳蛋白亚基和RNA组装成新的病毒粒体。,水稻矮缩病毒在传播介体叶蝉单层培养细胞内的侵染过程，包括侵入、复制、装配、扩散及释放等过程。,水稻矮缩病毒（dsRNA）在其介体昆虫体内的复制过程,1. 侵入 侵入昆虫介体细胞途径：受体依赖的、被膜小泡(clathrin-coated vesicles)介导的内吞运动,RDV以内吞作用进入介体细胞，随后进入早期内体（early endosones),early endosomes,clathrin-coated vesicles,Expression of P2 protein on S
21、f9 cells surface, induced membrane fusion,RDV infection induced membrane fusion in host insect vector cells,Mock,RDV infection,RDV 外壳蛋白P2与介体细胞受体特异性识别并导致介体细胞膜融合,P2,RDV P2介导病毒侵入介体细胞模型,The model of RDV entry its insect vector cells,2. 复制 植物呼肠孤病毒复制和装配场所：病毒原质,叶蝉细胞中的病毒原质（viroplasm，V),V,V,V,Nucleus,V,V,V,V
22、,V,V,V,V,叶蝉细胞中的病毒原质（viroplasm，V),viroplasm,P8,Viroplasm matrix proteins Pns6, 11, 12,Core proteins P1, 3, 5,7,mRNA,Outer capsid proteins P2, 8, 9,在RDV侵染昆虫介体细胞6小时后，与病毒早期复制相关的非结构蛋白Pns6、Pns11和 Pns12首先被翻译，相互结合聚集形成病毒原质(viroplasm)的基质，RDV复制和病毒内壳装配在基质上完成，完整病毒粒体在基质边缘装配完成。,VP,MT,磷酸化蛋白Pns4形成直径为10nm的微丝结构，围绕在vir
23、oplasm周边，可能辅助完整病毒粒体的装配。,RDV基因组结构和编码蛋白： 结构蛋白（P1、P2、P3、P5、P7、P8 和 P9); 非结构蛋白（Pns4、Pns6、Pns10、Pns11、Pns12）,植物呼肠孤病毒复制模型,The model of core particles assembly within the matrix of viroplasm,RDV在viroplasm内复制和装配过程,P1,P5,P3,P7,dsRNA,RDV在viroplasm内的内核粒体构造,安,RDV在viroplasm内的病毒内核粒体构造,RDV在viroplasm边缘的完整双层病毒粒体构造,3
24、. 扩散 植物呼肠孤病毒在介体细胞内扩散的安全通道：非结构蛋白Pns10形成的管状结构,The model of the cell-to-cell spread of RDV exploiting Pns10-tubules in its insect vector cells,Virus-containing Pns10 tubules transport along actin-based filopodia from leafhopper cells,actin-based filopodia,Pns10 tubules,Actin,Pns10 tubule,The closed end
25、 of virus-containing tubules in leafhopper cells,Pns10,P9,Pns6, P5, P8, P2, P1, P3, P7,Tubules protruded from Sf9 cell surface and connected neighboring cells,Tubules,Arrows: Pns10-AB-15 nm immuno-gold particles,The transmembrane domain within RDV Pns10 is required for tubule formation; the inhibiti
26、on of the ER-Golgi secretory pathway also disrupts tubule formation in Sf9 cells.,Pns10 tubules,Viral particles,Merged,Pns10 tubules,actin,Merged,Pns10 tubules,myosin,Merged,Virus-containing Pns10 tubules transport along actin-myosin based filopodia from leafhopper cells to adjacent healthy cells,Th
27、e model of the cell-to-cell spread of RDV exploiting Pns10-tubules in its insect vector cells,Rice root,Midgut of insect vector leafhopper,Cell wall,Tubule never associated with cell-wall plasmodesmata in rice plants pass through the microvilli of the midgut of viruliferous N. cincticeps Function on
28、ly in insect vector, not in plant host?,4. 降解与释放 RDV从细胞释放的一种奇特的途径：膜状囊泡跨膜运输,3hr after viral infection,吞噬性空泡,叶蝉的昆虫天然免疫系统中的细胞免疫机制在RDV侵染早期被激发，导致大量的RDV病毒粒体通过细胞吞噬作用进入大型的吞噬性空泡，执行细胞内降解功能。,叶蝉的昆虫天然免疫系统中的细胞免疫机制在RDV侵染后期被激发，导致大量的RDV病毒粒体通过大型的多重膜囊泡，执行细胞释放功能。,72hr after viral infection,多重膜囊泡,外吐小泡,病毒侵染晚期，多重膜囊泡位于细胞边缘
29、、与胞膜融合、释放外吐小泡，执行细胞释放功能,72hr after viral infection,merged,viral antigen,viroplasm,lysosome,viral antigen,actin,merged,viral antigen,Lysosome-containing multivesicular compartments,multivesicular compartments fused with plasma membrane, virions released,Exosome,The incorporation of lysosome in virus-c
30、ontaining inclusion which could release from infected cells.,病毒侵染晚期，多重膜囊泡位于细胞边缘、与胞膜融合、释放外吐小泡，执行细胞释放功能,S6,S11,S12,entry,Coated pit,Vesicles,Early endosome,mRNA release,Early translation,Viroplasm,Replication,Transcription,12 mRNAs,Translation,Viral proteins,Pns6,11, 12,Pns6, 11, 12, P1, 3, 5, 7,Core
31、particles,Viral particles,P2, 8, 9,Pns4 minitubules,Pns10 tubules,MVB,Exosome,Viral assembly,The replication cycle of RDV in its insect vector cells: (1) entry; (2) mRNA release and early proteins translation; (3) virus replication within viroplasm; (4) virus assemble at the periphery of viroplasm;
32、(5) virus transport and release through Pns10 tubules or virus-containing multivesicular compartments.,Some Plant Viruses Induce Characteristic Inclusions,四、病毒在植物体内的移动,1. 病毒在细胞间的移动,胞间连丝,移动蛋白（MP）,Cell-To-Cell Movement,Wei et al. (2010) PLoS Pathogens 6(6): e1000962.,B,In the presence of TuMV infectio
33、n (48 hrs),CI-mRFP+GFP-REM,CI-mRFP+GFP-REM,48 hrs,A,48 hrs,72 hrs,CI-mRFP expressed alone,CI-mRFP expressed in the presence of TuMV infection,I,II,III,I,II,Cell-To-Cell Movement,Wei et al. (2010) PLoS Pathogens 6(6): e1000962.,CI-mRFP+HC-Pro,CI-mRFP+P3,CI-mRFP+VPg,CI-mRFP+CP,I,III,IV,II,I,III,IV,II,
34、V,30:1,20:1,10:1,5:1,2:1,CI-mRFP: P3N-PIPO,Cell-To-Cell Movement,(A)n,VPg,P1 HC-Pro P3,NIaVPg NIaPro NIb CP,6k2,6k1,131,9625,3079,3258,PIPO,P3N-PIPO,CI,Wei et al. (2010) PLoS Pathogens 6(6): e1000962.,TEV CI-mRFP alone,TEV CI(AA3,4)-mRFP alone,TEV-CI(AA100,101)-mRFP alone,TEV CI-mRFP +P3N-PIPO,TEV CI(AA3,4)-mRFP +P3N-PIPO,TEV-CI(AA100,101)-mRFP +P3N-PIPO,I,II,III,I,II,III,Cell-To-Cell Movement,Wei et al. (2010) PLoS Pathogens 6(6): e1000962.,2. 病毒的长距离移动,大部分植物病毒的长距离运输是通过植物的韧皮部（phloem）的，而甲虫传播的病毒可以在木质部（xylem）运输。,作业,病毒由哪些成分组成？各有说明功能？ 简要说明病毒壳体结构类型及其特点。 植物病毒基因组表达主要采用哪些策略？,