第五章核酸化学.ppt

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1、第四章 核酸化学,核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。 核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。,核酸概述,核酸发现简史,1868年，瑞士外科医生F. Miescher从细胞核中分离得到一种酸性物质，即现在被称为核酸的物质，实质是一种核糖核蛋白,19世纪末20世纪初,德国生理学家Kossel等对核酸化学组成进行了初步研究，其学生Levene继续研究了核酸的结构,1944 O. Avery DNA 是遗传物质,1928年，英国细菌学家，医生Fred Griffith的体内转化实验,Protease+,1944年，Avery的转换转化实验,噬菌体

2、感染实验,1953年，Watson ，Crick提出了DNA的双螺旋结构模型，使生物化学进入了分子水平时代。 1958年，Meselson和Stahl用同位素标记证明DNA的复制方式是半保留复制。 50年代以后，飞速发展，不仅分离出各种核酸，而且发展产生了遗传工程（基因工程）等生物技术。 目前，基因结构、表达、调节已成为现代生物化学和分子生物学研究中心。 1980年，生物学家、诺贝尔奖得主H.Dulbecco提出人类基因组计划，HGP （Human Genomic Project ）。 1990年，美国决定用30亿美元、15年时间完成HGP，中国于1999年加入并承担1%测序任务，现已基本完成

3、。 后基因组时代： 功能基因组学：蛋白质组学，细胞内基因表达的所有蛋白质。 结构基因组学：RNA组学，研究细胞全部功能RNA结构、作用。,核酸与蛋白质一样，是一切生物有机体不可缺少的组成部分。 核酸是生命遗传信息的携带者和传递者，它不仅对于生命的延续，生物物种遗传特性的保持，生长发育，细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。 因此，核酸的研究是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。,4.1.2 核酸的种类和分布,核酸分为两大类： 脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid （DNA） 核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA

4、）,DNA（脱氧核糖核酸） RNA（核糖核酸）,mRNA（信使RNA） tRNA（转运RNA） rRNA（核糖体RNA）,核酸,98核中（染色体中） 真核 线粒体（mDNA） 核外 叶绿体（ctDNA） DNA 拟核 原核 核外：质粒（plasmid） 病毒：DNA病毒,RNA主要存在于细胞质中,tRNA: 转移RNA rRNA: 核糖体RNA mRNA：信使RNA 其它RNA RNA病毒：SARS,特殊功能的RNA,非编码RNA(ncRNA) 小RNA(sRNA) Small nuclear RNA , snRNA（核） Small nucleoar RNA , snoRNA（核仁） Sma

5、ll cytoplasmic RNA , scRNA（胞质） microRNA、siRNA、piRNA Antisense RNA Ribozyme RNase P,RNA功能的多样性 1、参与蛋白质的合成 2、RNA的转录后加工与修饰 3、参与基因表达的调控 4、生物催化作用 5、遗传信息的载体 6、引物,第一节 核酸的基本化学组成,核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。,核酸 nucl

6、eic acid,核苷酸 nucleotide,核苷 nucleoside,磷酸 phosphate,嘌呤碱 purine base 或 嘧啶碱 pyrimidine base,（碱基 base）,核糖 ribose 或 脱氧核糖 deoxyribose,（戊糖 amyl sugar）,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 -D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,一、戊糖,-D-（+）呋喃核糖,-D-（+）呋喃脱氧核糖,1. 嘧啶（Pyrimidine）,二、碱基,RNA: C,U DNA: C,T,2. 嘌呤（Purine）,接近平面，具有固定键长、键角；,酮式和烯醇式互变，氨

7、基态和亚氨基态互变。,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,7-甲基鸟苷酸,5-甲基胞苷,N6-甲基腺苷,N2-甲基鸟苷,5-羟甲基胞苷,次黄嘌呤核苷,假尿嘧啶核苷,4-硫代尿苷,7-甲基鸟苷酸,三、核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,嘧啶碱： C1 N1，嘌呤碱： C1 N9。 核酸中的核苷与脱氧核苷均为-型 碱基平面与核糖平面互相垂直 戊糖的标号为,RNA：中的核苷称核糖核苷（或称核苷）：腺苷（A）、鸟苷（G）、胞苷（C）、尿苷（ U ） 。 DNA ：中的核苷称脱氧核糖核苷（或称脱氧核苷

8、）：脱氧腺苷（dA）、脱氧鸟苷（dG） 、脱氧胞苷（dC）和脱氧胸苷（dT），“d”表示脱氧。,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,RNA: 尿嘧啶核苷 DNA: 脱氧胸腺嘧啶核苷,DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMP RNA： AMP、 GMP、 CMP、 UMP,1、 构成DNA、RNA的核苷酸 DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMP RNA： AMP、 GMP、 CMP、 UMP,四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,磷酸所连接位置：3，5 磷酯键,核苷中戊糖C2 、C3、C5羟基被磷酸酯化,多聚

9、核苷酸（核酸）,多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH 与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,核酸的连接方式 单核苷酸之间的连接键：3, 5 -磷酸二酯键 核酸链的二个游离末端: 5磷酸基末端 3羟基末端 书写方向： 5 3,没有分枝，线性结构（原核可成环） 方向性：链两端的核苷酸残基不同,书写时， 5端在左侧， 3端在右侧,2、 细胞内的游离核苷酸及其衍生物 核苷5-多磷酸化合物 ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG 在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。 环核苷酸 3,5-cAMP， 3,5-cGMP 信号分子，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代

10、谢。 核苷5多磷酸3多磷酸化合物 ppGpp pppGpp ppApp 核苷酸衍生物 HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。 GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。,核苷酸的衍生物,ATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物,ATP (腺嘌呤核糖核苷三磷酸),ATP 腺苷三磷酸 三磷酸腺苷 三磷腺苷 腺三磷,ATP的性质,ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能。 ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。 ATP 也是一种很好的磷酰化剂。磷

11、酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。,(2)GTP (鸟嘌呤核糖核苷三磷酸),GTP是生物体内游离存在的另一种重要的核苷酸衍生物。它具有ATP 类似的结构, 也是一种高能化合物。 GTP主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体。在许多情况下, ATP 和 GTP 可以相互转换。,cAMP 和 cGMP,cAMP(3,5- 环腺嘌呤核苷一磷酸)和 cGMP( 3,5-环鸟嘌呤核苷一磷酸)的主要功能是作为细胞之间传递信息的信使。 cAMP 和 cGMP 的环状磷酯键是一个高能键。在 pH 7.4 条件下, cAMP 和

12、cGMP 的水解能约为43.9 kj /mol，比 ATP 水解能高得多。,cAMP,cGMP,H,3,5-环腺苷酸,3,5-环鸟苷酸,3-二磷酸,5-二磷酸鸟苷,巯基乙胺,泛酸,3磷酸-腺苷二磷酸,尼克酰胺,腺苷,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸,核黄素,腺苷,黄素腺嘌呤二核苷酸,肌苷酸,IMP GMP,强力味精：5肌苷酸二钠 + 5鸟苷酸二钠,第二节 RNA的结构与功能,一、结构特点 碱基组成 A、G、C、U （AU/GC） 稀有碱基较多，稳定性较差，易水解 多为单链结构，少数局部形成螺旋 分子较小 分类 mRNA（hnRNA 核不均一RNA） tRNA rRNA （snRNA/asRNA） 少数R

13、NA病毒,RNA的类别及分布,一、细胞质RNA,1、核糖体RNA(rRNA),二、细胞核RNA,前体RNA（precursor RNA) ；不均一核RNA(hnRNA) 小RNA（snRNA)。,三、线粒体RNA与叶绿体RNA,四、病毒RNA,类病毒,植物病毒与一些肿瘤病毒,2、转移RNA(tRNA),3、信使RNA(mRNA),（一）、 RNA的一级结构 AMP、GMP、CMP、UMP通过3、5磷酸二酯键形成的线形多聚体。, 组成RNA的戊糖是核糖 RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一 些稀有碱基。 天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。,二、tRNA

14、(转移RNA),占RNA总量的15 一种氨基酸对应最少一种RNA,分子量25000左右，大约由7090个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。 分子中含有较多的修饰成分(稀有碱基)。 3-末端都具有CpCpAOH的结构。 5末端大多为pG或pC,tRNA的结构 二级结构是三叶草形 氨基酸臂 二氢尿嘧啶环 反密码环 额外环 TC环（假尿嘧啶环） 倒L形的三级结构,tRNA的功能： 转运氨基酸：氨酰tRNA 识别密码子 参与翻译起始 参与基因表达调控,三、rRNA （核糖体RNA）,占RNA总量的80，分子量相对较大，一般106 核糖体是蛋白质合成的场所，包含60%RNA，40%蛋白质，多数附着于内质网

15、上。,rRNA的功能： 组成核糖体 参与tRNA与mRNA的结合 肽基转移酶活性,四、mRNA和hnRNA,占细胞总RNA的35 它是蛋白质合成的模板。,真核细胞mRNA的3-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为 “尾结构” 5 -末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为“帽结构”。, 5-帽子：m7G 5 -ppp5-Nm（ Nm ）p-,由甲基化酶催化 可抵抗5核酸外切酶降解mRNA。 可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。, 3-端有一段约30-300核苷酸的polyA。 转录后由poly(A)聚合酶催化加尾 PolyA是mR

16、NA由核进入胞质所必需的形式。 polyA与mRNA半寿期有关， PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。,二、 DNA的结构,一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。 二级结构：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。 三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。,一、DNA的一级结构 脱氧核糖核酸的排列顺序 可以用碱基排列顺序表示 连接键：3，5-磷酸二酯键 磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架 碱基形成侧链 多核苷酸链均有5-末端和3-末端 DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,写法：

17、53： 5-pApCpTpG-3， 或5ACTG3, DNA一级结构的不均一性 （1）重复序列 正向重复,高度重复序列 （high repetive sequence, satelite DNA，SSR) 2-10bp/copy 105-106 copies/genome 多为串联重复排列（tandem repeats) 分布于着丝点、端粒区、结构基因两侧 中度重复序列（middle repetitive sequence) 0.1-1Kb/copy 10-104 copies/genome 多为间隔重复 rDNAtDNAHistone gene cluster 低拷贝重复：基因家族 单拷贝序

18、列（single copy sequence),反向重复（回文序列） (inverted repeat , palindrome sequence) 较长的回文结构，可形成茎环结构(发夹结构)或十字形结构 较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。 转录的终止作用与回文结构有关。,镜象重复（mirror repeat) 某些情况下可以三股螺旋DNA,（2） 富含AT的序列 很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT碱基对。特别是在复制起点和转录启动的Pribnow区，富含AT对。,2. 基因与基因组,基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能

19、单位（交换单位）。,基因组（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。 包括：核基因组（拟核/核DNA）及核外（质粒/质体DNA）,各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小,3. 原核生物基因组特点 重复序列少，多位编码区 多为操纵子形式组织 有重叠基因存在,真核生物基因组特点 以染色体存在 重复序列多,基因组计划 人类基因组计划（Human Genome Project， HGP ） 酵母基因组计划 （YGP） 大肠杆菌（E.Coli）,二、DNA的二级结构 DNA的双螺旋模型,1953年，J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍

20、射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。 在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,双螺旋结构模型(B-DNA) 两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条53，另一条35 磷酸与脱氧核糖彼此通过3、5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。 磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。 碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行 每圈螺旋含10个核苷酸，碱基堆积距离0.34nm，双螺旋平均直径2nm，,双螺旋结构模型(B-DNA) 两条核苷酸链之间依靠碱基间的氢键结合在一起。 碱基互补 螺圈

21、之间主要靠碱基平面间的堆积力维持,双螺旋结构模型(B-DNA) 大沟：宽1.2nm ，深0.85nm， 小沟 ：宽0.6nm，深0.75nm,A型结构 碱基平面倾斜20，螺旋变粗变短，螺距23nm。 RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。 Z型结构 左手螺旋，外形细长。 天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。,2、稳定双螺旋结构的因素 碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力） 形成疏水环境（主要因素） 。 碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。 磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。 碱基处于双螺旋内部

22、的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。,（4） 三股螺旋DNA,通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合： oligo(Py) : oligo(Pu)oligo(Py/Pu),T= A : A , CG ： C+ T = A : T CG ： G,三股螺旋DNA中的Hoogsteen-bonding,当DNA的一段寡嘧啶（寡嘌呤）构成镜像重复时可以形成三股螺旋（铰链DNA，hinged DNA , H-DNA),DNA三股螺旋结构常出现在DNA复制、转录、重组的起始位点或调节位点，如启动子区。 第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从

23、而阻遏有关遗传信息的表达。,G-四联体螺旋结构,真核生物染色体端粒中富含G序列，易形成G四联体螺旋结构,二、DNA的三级结构,DNA双螺旋的进一步扭曲构成三级结构 原核 双链环状DNA（dcDNA） 病毒 单链环状DNA（scDNA） 单链线性DNA（ssDNA）,1、 环状DNA的三种典型构象,（1）、 松弛环形DNA 线形DNA直接环化 （2）、 解链环形DNA 线形DNA拧松后再环化 （3）、 正超螺旋与负超螺旋DNA,LTW,连环数 缠绕数 超螺旋数,连环数（linking number , L） DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数 缠绕数（twisting numb

24、er, T） DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目 超螺旋数（缠绕数 , writhing number , W）,L=T+W,负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起（L），很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等 负超螺旋：超螺旋方向与双螺旋方向相反。 天然DNA都呈负超螺旋,拓扑异构酶 改变DNA拓扑异构体的L值。 拓扑异构酶酶I（解旋酶） 能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每次催化使L值增加1。 拓扑异构酶酶II（促旋酶） 能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2。,真核 双链线性DNA（dsDNA）,DNA的存在形式,从DNA到染色质丝，

25、DNA压缩了近100倍，若从DNA到最后凝缩成染色体，DNA压缩了近万倍。,螺旋管,组蛋白八聚体：H2A H2B H3 H4各2个分子,染色质的高级结构,第五节 核酸的性质,二、核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 以A260/A280进行定性、定量 DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光,鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A26

26、0/A280比值明显降低。 判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）,摩尔吸光系数：每升含一摩尔磷的核酸溶液（pH7）的消光系数,三、核酸的变性、复性与分子杂交,1. 变性 稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。 变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应） 变性因素 pH（11.3或5.0） 变性剂（脲、甲酰胺、甲醛） 低离子强度 加热,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达

27、最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85C之间。,2. 热变性和Tm,影响DNA的Tm值的因素,DNA均一性 。 均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性 。,G-C含量与Tm值成正比。 测定Tm，可推知G-C含量。 G-C%=（Tm-69.3）2.44,介质中离子强度 离子强度高，Tm高。,3. 核酸的复性,变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性

28、，因此又称为“退火”。 退火温度Tm25 复性影响因素 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/ 溶液离子强度,4.分子杂交,DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。 Southern 杂交（Southern bolting） Northern 杂交（Northern bolting） Western 杂交 （Western bolting）,1、 Southern Blotting DNA样品 酶切 电泳 碱变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影 Sou

29、thern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。,2、 Northern Blotting 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。 总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）,3、 Western Blotting 抗原与抗体的杂交 研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。,Eastern blot ?,一、 核酸的分离纯化和定量 尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。,核酸研究技术,（一）、 DNA分离纯化 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L N

30、aCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用SDS法，氯仿异戊醇法去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-无水乙醇沉淀,（二）、RNA的制备 RNase 的灭活： 玻璃器皿：140-200，8小时 塑料器皿：0.1%DEPC，37，过夜 缓冲液饱和酚直接提取RNA 提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍 反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂 对不同的RNA应该先提取细胞器，然后再从细胞器中提取目标RNA,核苷酸、核苷的分离,1、离子交换法,2、凝胶

31、过滤,（三）、核酸的定量 1、紫外分光光度法 2、定磷法：DNA/RNA 3、定糖法：RNA核糖 糠醛 绿色,浓HCl/H2SO4,地衣酚,DNA脱氧核糖,蓝色,冰醋酸/浓H2SO4,二苯胺,强酸,无机磷,磷钼酸,还原,蓝色,4、琼脂糖凝胶电泳,核酸纯度的测定,紫外吸收法,A260/A280,1.8 蛋白或酚污染,=1.8 纯DNA,1.8 RNA污染,=2.0 纯RNA,核酸的沉降特性与超速离心,不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用CsCl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来 这一方法常用于质粒DNA的纯化。,RNADNA 变性DNA双链DNA 蛋

32、白质， 变性程度越大，浮力密度越大,三、 核酸的凝胶电泳,（一）、 琼脂糖电泳,用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广,影响迁移率的因素： 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 凝胶浓度 DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。 电压，不大于5V/cm 染色：0.5ug/ml EB RNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛,琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定,琼脂糖电泳可以用于DNA的制备与纯化,（二）、 PAGE电泳 用于小片段DNA的分析，精度非常高,一、核酸的水解,（一）酸水解 对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键 嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键 脱嘌呤： pH1.6，37，对水透

33、析 pH2.8，100，1h 脱嘧啶： 98-100%甲酸，175，2h 三氟乙酸，155，60min（DNA）或80min（RNA） 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成,（二）、 碱水解 RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温，0.31mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解，得到2-或3-核苷酸的混合物。 DNA抗碱水解 生理意义： DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。,（三）、 酶水解 非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3-核苷酸 特异的磷酸二酯酶：核酸酶,1、核酸酶的分类 底物专一性：

34、 核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶 DNase 作用方式： 核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶 (endonuclease) 单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶 磷酸二酯键的断裂方式： 5-（寡）核苷酸 3-（寡）核苷酸,2、RNAase RNase H 作用于DNA-RNA中的RNA链 牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) , RNase I 最适pH ：7.0-8.2 产物：以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的外切酶 RNase T1 耐热、耐酸 产物：以3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高 RNase T2 产物：以3-腺苷酸结尾的寡

35、核苷酸,3、DNase 核酸酶S1 作用于单链DNA部分 牛胰核糖核酸酶，DNase I 切断双链或单链DNA 产物：以5-磷酸为末端的寡核苷酸 DNA限制性内切酶,二、 核酸的酸碱性质 磷酸和碱基均能发生两性解离。 DNA等电点 44.5 RNA 等电点 22.5,1、碱基的解离,2、核苷的解离,3、核苷酸的解离,四、核酸的序列测定,双脱氧链终止法（Sanger酶法） 2. Gilbert化学降解法,DNA序列分析 （一） 双脱氧终止法,DNA片段的扩增,DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP,（二） 化学裂解法 Maxam-Gilbert ， 1977 原理： 利用特异性的化学裂解

36、法，制备出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群经测序胶电泳和放射自显影得到测序图谱。 32P-GCTACGTA： 在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT 在G处： 32p ，32p-GCTAC 在C处：32P-G和 32P-GCTA 在T处：32P-GC和32P-GCTACG,G反应：硫酸二甲酯 G+A反应：甲酸/哌啶 C反应：肼/NaCl/哌啶 C+ T：肼/哌啶 哌啶：促使修饰化碱基脱落，并使脱碱基的磷酸二酯键断裂,硫酸二甲酯（G）： *ACTTCG *ACTTCGACAG 甲酸（G+A）： *A *ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA *ACTTCGACAG,肼/Nacl（C）： *AC *ACTTC *ACTTCGA C *ACTTCGACAG 肼（C+T）： *AC *ACT *ACT T *ACTTC *ACTTCGAC *ACTTCGACAG,32P *ACTTCGACAG,七、DNA的化学合成： 合成方向：3 5端 5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。 3-OH用氨基亚磷酸化合物活化 碱基上氨基用苯甲酸保护,对苯二甲酸二甲酯,4.6 核酸的生物功能和实践意义,生理功能： 生物体生命活动所需能量的直接供体(ATP) 是合成DNA、RNA的原料 是某些辅酶（基）的组成成分 调节体内代谢(cAMP cGMP),