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1、改变花色的转基因矮牵牛花,转入荧光素酶蛋白基因的发荧光烟草,蓝色玫瑰一直是人类美丽的梦想基因工程已将它变为现实,转 基 因 西 红 柿,由于细菌个体微小、遗传物质较为简单，易于人工培养，繁殖速度快，突变型容易识别和检出。因此，细菌一直被用做研究生物遗传与变异规律的实验材料。,利用人工诱变或杂交选育医药或食品工业中所需要的高产菌株。 利用分子生物学技术，构建“基因工程菌”，生产新药、疫苗、食品添加剂，或者用于环保等。,一、细菌遗传的物质基础 二、细菌的基因小胸泳衣突变 三、细菌的基因转移与重组 四、微生物基因组学 五、基因工程菌株的构建,细菌的遗传与变异,1、细菌染色体基因组结构,细菌染色体是一
2、个裸露的闭合环状的双链DNA分子，有核蛋白，缺乏组蛋白，无核膜包裹。,一、细菌遗传的物质基础,细菌基因组结构的主要特征：,（1）遗传信息是连续的，不含内含子。很少有重复序列。,（2）通常，编码相关功能的基因高度集中，组成操纵子（operon）结构，自一个启动子开始转录成多基因的mRNA分子，翻译成多种功能相关的蛋白质。,一、细菌遗传的物质基础,2、质粒（plasmid）,一、细菌遗传的物质基础,是细菌染色体外的遗传物质，大多由闭合环状双链DNA组成。, 具有自我复制的能力。 所携带的基因赋予宿主菌某些生物学 性状（如F质粒、R质粒、毒力质粒、 代谢质粒），增加小胸泳衣细菌的存活机会。 非生存所
3、必需，可自行丢失或消除。 可在细菌之间转移。,质粒DNA的特征,一、细菌遗传的物质基础,1)致育质粒（F质粒）与有性生殖功能关联； 2)耐药性质粒 编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性。分两类，一是接合性耐药质粒（R质粒），另一是非接合耐药性质粒； 3)毒力质粒（Vi质粒） http:/ 编码与该菌致病性有关的毒力因子； 4)细菌素质粒 编码细菌产生细菌素； 5)代谢质粒 编码产生相关的代谢酶。,一、细菌遗传的物质基础,3、转座子（transposon）,一、细菌遗传的物质基础,是一个DNA片段（2kb），可在质粒与质粒之间或质粒与染色体之间随机转移，故又称为“跳跃基因” 。 转座子不能自我
4、复制。,转座子,质粒,转座子的结构特点, 2个末端反向重复序列：能为整合酶所识别，与插入功能有关。,一、细菌遗传的物质基础, 中心序列：带有遗传信息，如常带有耐药基因、细菌毒素基因、整合酶（或转座酶）基因。,一、细菌遗传的物质基础,当转座子插入到某一基因组中，可能会产生什么遗传学效应？,一、细菌遗传的物质基础, 可引起插入基因失活，产生基因突变。 在插入部位又出现一个或多个耐药基因，使细菌产生耐药性或多重耐药性。,4、噬菌体（bacteriophage）,一、细菌遗传的物质基础,噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。,转座子,质粒,一、细菌遗传的物质基础 二、细菌的基因突变 三
5、、细菌的基因转移小胸泳衣与重组 四、微生物基因组学 五、基因工程菌株的构建,细菌的遗传与变异,基因突变（gene mutation）：细菌染色体基因发生突然而稳定的结构改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入 或置换（点突变：point mutation）， 导致细菌性状的遗传性变异。,1、概念,二、细菌的基因突变, 随机发生，不定向 稳定 自发突变产生频率为10-1010-6 可诱发性：野生株、突变株,2、特点,二、细菌的基因突变, 耐药性突变：选择标记 毒力突变：疫苗研制、新现传染病 营养缺陷体突变：新药诱变作用检测 高产突变：抗生素等药品、食品生产 抗原性突变：逃逸免疫机制,3、突变现象
6、,二、细菌的基因突变,日本发生过一次细菌性痢疾大流行。从病人粪便中分离到大量的痢疾杆菌敏感株和耐药株（同时耐链霉素、氯霉素、四环素、磺胺类），且大肠杆菌与痢疾杆菌有完全相同的多重耐药性。多重耐药性传播迅速。耐药菌在传代、保藏过程中可自发失去耐药性。 能否用基因突变解释以上现象？,三、细菌的基因转移与重组,一、细菌遗传的物质基础 二、细菌的基因突变 三、细菌的基因转移与重组 四、微生物基因组学 五、基因工程菌株的构建,细菌的遗传与变异,供体菌（donor）将遗传物质转移至受体菌（recipient），使后者获得新的生物学性状，称为基因转移（gene transfer）。 细菌通过水平方向的基因转
7、移和重组，产生新的基因型个体，以适应随时改变的环境。,基因转移的概念,三、细菌的基因转移与重组, 质粒（plasmid） 转座子（transposon） 温和噬菌体（temperate phage）,基因转移的元件,三、细菌的基因转移与重组, 接合（conjugation） 转化（transformation） 转导（transduction） 转座（transposition）,基因转移的方式,三、细菌的基因转移与重组,1、接合（conjugation）,三、细菌的基因转移与重组,接合：供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，并将遗传物质（主要是质粒DNA）转移给受体菌，http:/使受体菌获得新
8、的遗传性状。,三、细菌的基因转移与重组,质粒,质粒接合转移示意图,染色体,性菌毛,受体菌,供体菌,三、细菌的基因转移与重组,赋予宿主菌的耐药性,编码性菌毛，决定自主复制与接合转移,耐药性（R）质粒,三、细菌的基因转移与重组,R质粒主要以接合方式从耐药菌传递给敏感菌，使后者变为耐药菌。 R质粒在同一种属或不同种属细菌之间传递，造成耐药性的广泛传播，尤其在肠道杆菌中比较普遍，给临床治疗带来很大困难 。,三、细菌的基因转移与重组,日本发生过一次细菌性痢疾大流行。从病人粪便中分离到大量的痢疾杆菌敏感株和耐药株（同时耐链霉素、氯霉素、四环素、磺胺类），且大肠杆菌与痢疾杆菌有完全相同的多重耐药性。多重耐药
9、性传播迅速。耐药菌在传代、保藏过程中可自发失去耐药性。 能否用基因突变解释以上现象？,三、细菌的基因转移与重组,三、细菌的基因转移与重组,三、细菌的基因转移与重组,三、细菌的基因转移与重组,三、细菌的基因转移与重组,因子和接合,三、细菌的基因转移与重组,雄性菌株与雌性菌株接合结果,三、细菌的基因转移与重组,Griffith肺炎链球菌感染小鼠实验（1928）,无荚膜活菌,有荚膜活菌,有荚膜死菌,三、细菌的基因转移与重组,有荚膜的活菌？,三、细菌的基因转移与重组,活的无荚膜肺炎链球菌从死的有荚膜肺炎链球菌中获得荚膜（毒力决定因子）编码基因，称之为转化（transformation）。 引起转化现象
10、的物质称为转化因子。,Avery研究揭示，转化因子的本质是DNA，即遗传物质是DNA。1944年，获得诺贝尔医学生理学奖。,三、细菌的基因转移与重组,2、转化（transformation）,三、细菌的基因转移与重组,转化：受体菌从周围环境中直接摄取供体菌游离的DNA片段，并整合入受体菌基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的过程。,三、细菌的基因转移与重组,（1）转化的前提条件, 供体菌DNA片段的大小： 1020 个基因 供体DNA性质：同源性高的、未变 性的双链DNA；质粒DNA。 受体菌的生理状态：处于“感受态”,三、细菌的基因转移与重组,（2）自然转化过程,三、细菌的基因转移与重组,1
11、、受体菌处于感受态(competence) Ca2诱导法、电穿孔法 受体细胞经过一些特殊方法处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。, 转化因子的结合与进入 双链DNA与感受态受体菌表面的DNA结合受体结合。其中一条链被降解产生能量；另一条链与特异DNA结合蛋白形成复合物，进入菌体内。,三、细菌的基因转移与重组, 转化因子的整合 单链DNA不经复制，与受体菌同源DNA区段的单链配对，被取代的受体菌DNA单链被降解，最终 产生转化子。,三、细菌的基因转移与重组,有荚膜的活菌？,三、细菌的基因转移与重组,3、转导（transduction）,三、细菌的基
12、因转移与重组,以温和噬菌体为媒介，将供体菌DNA片段（染色体DNA、非接合性质粒DNA）转移到受体菌内，通 过基因重组而使受体 菌获得新的遗传性状。,三、细菌的基因转移与重组,（1）转导的概念, 是感染细菌、放线菌、真菌等的病毒。 分为头部和尾部。头部由核心（核酸） 和衣壳（蛋白质）构成。 能通过细菌滤器。 须寄生在活的易感宿主 菌体内。,三、细菌的基因转移与重组,（2）噬菌体（phage）,（3）温和噬菌体,烈（毒）性噬菌体（virulent phage）：噬菌体在宿主菌体内复制增殖，产生大量子代噬菌体，并最 终裂解细菌，建立 溶菌周期。,三、细菌的基因转移与重组,三、细菌的基因转移与重组,
13、温和噬菌体（temperate phage）：感染宿主菌后，不立即增殖，而是将其核酸整合到宿主菌染色体基因组中，与宿主菌DNA一起复制， 并随细菌的分裂而传 至子代细菌。,前噬菌体,溶原性细菌,有些温和噬菌体可使溶原性细菌的表型发生相应改变，称之为溶原性转换（lysogenic conversion）。例如，白喉棒状杆菌若携带噬菌体时，可产生白喉毒素。,三、细菌的基因转移与重组,溶原性细菌能正常以二分裂方式繁殖，前噬菌体也一代一代传下去。但有时也会自发终止（发生 率10-5），从染色体上 脱落，进入溶菌周期。,三、细菌的基因转移与重组,（4）转导的机制,前噬菌体从染色体上脱离进行增殖，装配成新
14、的子代噬菌体。大约在105107次装配中发生一次错误，误将大小合适的供体菌DNA片段装入噬菌体头部，成为“假噬菌体”。,三、细菌的基因转移与重组,假噬菌体,供体菌,当“假噬菌体”（转导噬菌体）再度感染受体菌时，将供体菌DNA带入受体菌内。,完全转导与流产转导,普遍性转导、局限性转导,三、细菌的基因转移与重组,假噬菌体,受体菌,供体菌DNA,4、转座（transposition）,三、细菌的基因转移与重组,转座子在质粒之间或质粒与染色体之间的自行转移现象，称之为转座 。,转座子能在2个没有任何同源性的基因组之间转座（即插入到某一基因），并能引起一系列遗传效应。 可引起插入基因失活，产生基因突变。
15、 在插入部位引入一个或多个新的基因 （如耐药基因、毒素基因。,三、细菌的基因转移与重组,转座子的自行转移不需要核苷酸碱基对同源才能插入，可在革兰阴性菌和革兰阳性菌之间转移。,三、细菌的基因转移与重组,一、细菌遗传的物质基础 二、细菌的基因突变 三、细菌的基因转移与重组 四、微生物基因组学 五、基因工程菌株的构建,细菌的遗传与变异,微生物基因组学（Genomics）是利用全基因组DNA序列研究微生物基因及其功能的学科。,四、微生物基因组学,细菌是研究和分析基因组序列与相关生物学功能关系的理想模式。,首先，用超声波将细菌染色体DNA随机切割成一定大小的DNA片段，插入到测序载体（质粒）中，以构建D
16、NA文库，进行大规模的测序，对DNA序列加以拼接。,1、核苷酸序列测定,四、微生物基因组学,经过计算机分析，完成全基因组各个区域的编号和注释，最后存入数据库，并在互联网上发表，以供全世界的科学家参考和使用。,四、微生物基因组学,细菌全基因组序列测定完成后，更重要的任务是鉴定基因及尽可能确定基因的功能，称之为后基因组学。,2、微生物基因组结构与功能研究,四、微生物基因组学,3、微生物基因组学研究的意义,四、微生物基因组学,根据病原菌全基因组序列，应用现代生物信息软件对基因序列进行分析，可确定哪些基因与毒力、体内定居或体内持续感染有关，从而阐明病原菌致病基因及其产物。,（1）揭示病原微生物的致病机
17、制,四、微生物基因组学,从分子和细胞水平上，揭示微生物与宿主之间的相互作用，更深入地阐明病原微生物的致病机制，诸如毒素作用机制、宿主细胞中微生物的受体，侵入细胞内微生物的定位和新表位的发现，对宿主免疫系统的反应等。,四、微生物基因组学,（2）建立灵敏特异的基因诊断技术,传统的病原体诊断依赖于致病微生物的形态、培养和生化特征。 通过测定多种致病与非致病微生物的基因组序列，可以获得大量的基因信息。如特异DNA序列用于诊断，菌株特异性基因用于分型。,四、微生物基因组学,图2 引物特异性单重PCR电泳结果 m 100bp Marker， 1 CMCC51252, 2 CMCC51572, 3 CMCC
18、51592, 4 GIM-Shi1, 5 GIM-Shi2, 6 ATCC9027, 7 ATCC15442, 8 CMCC10104, 9 GIM-Ps, 10 ATCC43889, 11 GDCIQ-O157-1, 12 GDCIQ-O157-2, 13 CMCC50093, 14 CMCC50071, 15 CMCC50115, 16 CMCC47001, 17 GIM-Vp, 18 GDCIQ-Vp,（3）开发新型抗菌药物,病原菌全基因组序列的测定，一方面，能揭示细菌耐药的确切机制，对现有抗菌药物进行改造或开发新型药物。,四、微生物基因组学,另一方面，可使药物的研发策略从筛选化合物库转
19、向优先筛选靶位基因，即以病原菌为目标，找出在人类基因组中缺失，对耐药菌生存必不可少并在感染过程中优先表达的基因；选择这些基因作为抗菌药物的靶位点，可设计出具有针对性很强的药物（窄谱抗生素）。,四、微生物基因组学,病原菌全基因组序列的测定，还可大大加速新疫苗的研制。,（4）开发新型疫苗,四、微生物基因组学,通过生物信息学软件，对全基因组序列进行分析，可预测出病原体的具有很高免疫原性的保护性抗原及其表位。 将抗原或表位编码基因在合适的载体系统中表达，分离纯化目的抗原或表位。最后，检测抗原的安全性和有效性。,四、微生物基因组学,随着微生物基因组被解码和微生物功能基因组的研究与开发，微生物学正面临着革
20、命性的飞跃。微生物基因组研究所获得的信息将迅速转化为生产力，微生物感染性疾病的诊、防、治，将会彻底得到改观。,四、微生物基因组学,一、细菌遗传的物质基础 二、细菌的基因突变 三、细菌的基因转移与重组 四、微生物基因组学 五、基因工程菌株的构建,细菌的遗传与变异,目的基因,重组质粒,转化,目的蛋白,五、基因工程菌株的构建,重组DNA技术,基因工程菌,五、基因工程菌株的构建,质粒作为一种独立的复制子，容易从细胞中分离出来、在体外进行遗传操作和转入到合适的受体细胞中，表达外源目的基因。 自主复制，可表达外源基因 限制性酶切位点 选择性标记（耐药性）,五、基因工程菌株的构建,质粒可作为表达载体，首先在
21、体外构建重组质粒（携带目的基因）；再转入原核表达系统（大肠杆菌）或真核表达系统（酵母菌）中，构建“基因工程菌株”；大量表达目的基因，获得目的蛋白（如氨基酸、味精、抗生素、胰岛素、干 扰素、生长激素、乙肝疫苗）。,五、基因工程菌株的构建,幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的致病菌，并与胃腺癌 和胃部淋巴瘤的 发生密切相关。,立论依据,五、基因工程菌株的构建,我国人口Hp感染率为70%。目前主要采用的抗生素疗法（三联药物:埃索美拉唑阿莫西林克拉霉素 ）的疗效不甚理想，易复发。 疫苗被认为是控制Hp感染最有效的方法。,五、基因工程菌株的构建, 全菌
22、灭活疫苗 亚单位疫苗 由于以上疫苗各自的缺陷，目前尚无安全、有效的疫苗应用于临床。鉴于Hp经黏膜途径入侵人体，黏 膜免疫在抗感染免疫中起 有重要作用。,五、基因工程菌株的构建,构建高效表达幽门螺杆菌保护性抗原-黏附素的重组嗜酸乳酸菌，作为活载体口服疫苗，诱发有效的局部免疫应答，保护机体抵抗感染。,五、基因工程菌株的构建,设计幽门螺杆菌黏附素Bab引物，引入酶切位点,培养幽门螺杆菌标准菌株,抽提核酸,PCR扩增Bab基因,构建表达载体pMD18-T,转化进E.coli DH5受体菌，筛选转化成功的细菌,抽提质粒,双酶切，鉴定，回收Bab片断,克隆入嗜酸乳杆菌质粒pMG36e,电穿孔法转化,在嗜酸
23、乳杆菌中表达，获得重组嗜酸乳杆菌,鉴定目的蛋白表达效果,pMG36e是组成型表达质粒载体，可在乳酸菌、大肠杆菌中自我复制 。大小为3.6kb，含红霉素耐药基因、P32启动子、多克隆位点和prtp转录终止子。,实验结果,引物设计: P1 5-GGAATTCATGAAAACATTTGAA-3 EcoR I P2 5 -GCTCGAGTTAAGCCAAATGGGC-3 Xho I,五、基因工程菌株的构建,2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp, PCR扩增Bab基因,五、基因工程菌株的构建, Bab基因测序及序列分析,五、基因工程菌株的构建, Bab基因克隆至表达载体,1：EcoR I/Xho I双酶 切重组质粒,2： PCR 扩增Bab基因,五、基因工程菌株的构建, Bab生物信息学分析,五、基因工程菌株的构建, Bab在嗜酸乳杆菌中的表达,五、基因工程菌株的构建,哈哈， 下 课 了 !,谢谢！,