第六章_微生物的生长及其控制.ppt

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1、第六章 微生物的生长及其控制 本章的学习目的与要求 1.了解测定微生物生长繁殖的基本方法，熟练掌握血球计数板法和平板稀释计数法的原理和基本操作过程。 2. 理解微生物的生长规律，熟练掌握单细胞微生物的典型生长曲线定义，各个生长时期的含义和特点，并灵活运用这些知识来分析和解决一些实际问题。 3. 理解微生物的连续培养，掌握恒浊器连续培养法和恒化器连续培养法的定义和特点，了解连续发酵。 4. 了解影响微生物生长的主要理化因素。 5. 了解常规的微生物培养方法，掌握常规固体培养法和液体培养法。,6. 掌握控制有害微生物的几个重要概念；熟练掌握高温灭菌的种类和相应的参数条件，特别是湿热灭菌方法(巴氏消

2、毒法、超高温瞬时灭菌法、连续灭菌法及高压蒸汽灭菌法的注意事项)；高温灭菌对培养基成分的有害影响及其防止措施。 7. 了解几种常用化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂的种类和功效，以及其杀菌、抑菌原理，熟练掌握抗代谢药物磺胺类药物的治疗机制，抗生素的概念以及抗药性产生的机理等。,个体生长个体繁殖群体生长 群体生长个体生长个体繁殖 生长是一个逐渐发生的量变的过程，是繁殖的基础；繁殖是一个质变的过程，是生长的结果。,生长： 指细胞物质有规律、不可逆增加的过程。是有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。,繁殖： 是微生物生长到一定阶段，由于细胞内各种细胞结构的复制和重建，导致产生一个新的细胞个体，即引起细胞个体数

3、量增加的整个生物学过程。,单细胞：由于细胞分裂引起个体数目的增加。 多细胞：通过无性或有性孢子使个体数目增加的过程。,第一节 测定生长繁殖的方法 第二节 微生物的生长规律 第三节 影响微生物生长的主要因素 第四节 微生物培养法概论 第五节 有害微生物的控制,（二）间接法 1、比浊法： 微生物培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增高。 用分光光度计在可见光的450650nm波段内测定培养物的吸光度。,第一节 测定生长繁殖的方法,一、测生长量,（一）直接法 1、测体积：在刻度离心管中测沉降量。粗放 2、测干重：可用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%20%。 精确

4、,2、生理指标法 测定与微生物生长量相平行的生理指标。 1) 测含氮量； 用凯氏定氮法等测其总氮量，再乘以系数625即为粗蛋白含量。蛋白含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。 2) DNA含量测定法 采用适当的荧光指示剂或染色剂与菌体DNA作用，利用荧光比色或分光光度计法测得DNA的含量。 3) 其他生理指标法 测定碳、磷、RNA、ATP、DAP(二氨基庚二酸) 等的含量。 此外，产酸、产气、耗氧、粘度和产热等指标，有时也应用于生长量的测定。,二、计繁殖数 测定单细胞微生物的个体数目、丝状微生物的孢子数。,1、直接计数法（全数）血球计数板法 是测定一定容积中的细胞总数目的常规方法。特点是测定简

5、便、直接、快速，但测定的对象有一定的局限性，只适合于个体较大的微生物种类。,2、间接计数法（活菌数）稀释平板菌落计数法 是一种最常用的活菌计数法，包括浇注平板法和涂布平板法。,一、微生物的个体生长与同步生长,第二节 微生物的生长规律,（一）细胞周期： 指从一个新细胞的产生到分裂出两个子细胞的全过程。它可简单地分为两个相互延续的时期，即细胞分裂期和分裂间期。分裂间期是细胞增殖的物质准备和积累阶段，分裂期则是细胞增殖的实施过程。,（二）观察微生物个体生长的方法：,1、通过电子显微镜观察细胞的超薄切片：,2、同步培养法技术： 设法使某个群体中的所有个体细胞尽可能处于同样细胞分裂和生长周期中，然后通过

6、分析此群体在各阶段的生物化学特性变化来间接了解单个细胞的相应变化规律。 同步生长 ：通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，称为同步生长。,(1)环境条件诱导法： 1）温度调整法：亚适生长温度最适生长温度培养。 2）营养条件调整法：控制浓度或组成，使细胞只能进行一次分裂。 3）用稳定期的培养物接种：稳定期细胞处于衰老状态，移入新鲜培养基，可得同步生长。 4）抑制DNA合成法：DNA合成是细胞分裂前提。抑制一段时间再解除抑制,(2)机械筛选法：利用物理方法从不同步的细菌群体中选择出同步的群体。 1)选择性过滤法： 2)密度梯度离心法： 3)膜洗脱法某些滤膜可以吸附带相反

7、电荷的细胞，其过程：吸附、翻转洗脱 同步性只能保持23代,二、微生物的群体生长规律 （一）微生物在分批培养中的生长规律： 分批培养即接种少量微生物在一密闭系统中生长繁殖，直到某些营养物耗尽，或有些代谢产物积聚到毒害浓度为止。 1、典型生长曲线 将少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中培养。在适宜条件下，其群体就会有规律地生长，定时取样测定细胞含量，以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，就可以画出一条有规律的曲线，这就是微生物的典型生长曲线。 意义：描述单细胞微生物从生长开始到衰老死亡的一般规律。 适用对象： 单细胞微生物：细菌、酵母 不适合丝状生长的真菌或放线菌,2、典型生长

8、曲线的分期及各分期的意义,(1)延滞期(停滞期、调整期)： 是指把少量微生物接种到新培养液中后，在开始培养的一段时间内，细胞数目不增加的时期。 1)特点： a.生长速率常数为零； 生长速率常数：每小时的分裂代数。 b.细胞形态变大或增大； c.细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。 d.合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加速，易产生各种诱导酶 ； e.对外界不良条件的反应敏感。,3) 缩短延滞期的手段： 以对数期的菌体作种子菌 ； b. 适当增大接种量 ：一般采用3%-8%的接种量，根据生产上的具体情况而定，最高不超过1/10。,2) 形成原因：调整代谢，合成新的酶系和中间

9、代谢产物以适应新环境。,c. 培养基的成分：种子培养基尽量接近发酵培养基 。,4)实践意义： 延滞期的长短直接影响发酵周期，发酵工业生产中要尽量缩短延滞期，选择对数期接种龄的细胞做种子，增大接种量，使发酵培养基的成分与种子培养基成分接近。,(2) 对数期 log phase 又叫指数期，指微生物在培养过程中以几何级数速度分裂的一段时期。在生长曲线中，紧接着延滞期后的一段时期。 1)特点：此时菌体细胞生长的速率常数R最大，分裂快，代时短，细胞进行平衡生长，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，群体的形态与生理特征最一致，抗不良环境的能力强。,2) 重要参数： a.繁殖代数n：指数生长

10、期愈长，n愈多，则菌体产量愈高。,X2 = X1 2n 以对数表示： lgX2 =lgX1nlg2 n = 3.322(lgX2lgX1),b.生长速率常数R：即每小时的分裂代数。,c.代时G：单个细胞完成一次分裂所需时间，亦即增加一代所需时间。受菌种、培养基营养成分的影响。,影响微生物对数期增代时间的因素较多，主要有： 菌种 ：不同微生物代时差别大。,营养成分： 同种微生物，营养丰富的培养基，其代时就短，反之则长。 营养物浓度：很低时影响。,固定环境条件，其他必需营养都过量，改变其中一特定生长必需底物的浓度，与比生长速度的关系可用Monod公式表示：,式中：,为最大比生长速度；,S为限制生长

11、底物浓度； Ks为比生长速度是最大比生长速度一半时的底物浓度；,当SKs时，,当KsS时，,生长限制因子： 凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物，就称生长限制因子。,营养浓度对生长速度和菌体产量的影响,培养温度： 在微生物的最适生长温度范围时，代时就短。,4)实践意义： 指数期的微生物是研究生理、代谢等的良好材料；是增殖噬菌体的最适菌龄；是发酵生产中用做种子的最佳种龄，通过补加营养物质延长指数期。,（3）稳定期 ： 即活细胞数保持相对稳定的时期。 1)特点： a.生长速率常数为零； b.菌体产量达到最高； c.活菌数相对稳定； d.细胞开始贮存贮藏物； e.芽孢在这个时期形

12、成； f.有些微生物在此时形成次生代谢产物。,2)形成原因； a.营养物尤其是生长限制因子的耗尽； b.营养物的比例失调； c.有害代谢产物的积累； d.物化条件的变化。 3)实践意义 a.是菌体或与菌体生长相平行的代谢产物的最佳收获期； b.是对某些生长因子进行测定的必要前提； 稳定期的重要参数生长产量常数Y： 指菌体产量与限制性营养物消耗的比例关系。,c.对连续培养技术的设计和研究有指导意义。 4）延长：补料，调pH、温度等。 4、衰亡期 即总活菌数明显下降的时期。 1)特点： a.细胞形态多样； b.出现细胞自溶现象； c.有次生代谢产物的形成； d.芽孢在此时释放。 2)形成原因： 不

13、利的外界环境引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。,丝状微生物的群体生长规律,丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。,可分为三个阶段： 1、生长停滞期 2、迅速生长期 3、衰退期,1、生长停滞期: 造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。 2、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分

14、支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。 3、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。,（二）微生物在连续培养中的生长规律 连续培养： 指微生物接种到培养基里以后的整个生长期间，微生物能持续地以比较恒定的生长速率常数进行生长，从而导致微生物的生长过程能“不断”地进行下去的一种培养方法。,单批培养和连续培养的关系：,1、原理： 当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平

15、衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,2、特点： 连续培养中微生物可长期保持指数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。 3、连续培养方法：,(1)按不同控制方式分： 1）恒浊连续培养：不断调节流速使培养液浊度保持恒定。 a. 装置恒浊器： 指根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速率恒定的微生物细胞的连续培养器。 b. 原理： 根据培养器内微生物的生长密度，用光电控制系统（浊度计）来检测培养液的浊度（即菌液浓度），并控制培养液的流速，从而获得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养液。当培养器中浊度增高时，通过光电

16、控制系统的调节，可促使培养液流速加快，反之则慢，以此来达到恒密度的目的。 c. 适用：收获菌体及与菌体相平行的产物。,测定所培养微生物的光密度值,自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速,使培养物维持在某一恒定浊度,当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低； 当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；,恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的,如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的生长速率。,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,2) 恒化连续培养： 恒定流速，及时补充营养，营养物浓度基本

17、恒定，从而保持恒定生长速率。又称恒组成连续培养。 a.装置恒化器 是通过控制培养液恒定的流速，来调节生长限制因子在营养液中的浓度，使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的连续培养装置。 b. 原理： 通过控制某一种营养物的浓度，使其成为限制性的因子，而其他营养物均为过量，这样，细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。随着细菌的生长，菌体的密度会随时间的增长而增高，而限制性生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速加入的新鲜培养基流速相平衡。这样，既可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，但能保持稳定菌体密度的菌体。 c

18、. 适用：科研,恒浊法与恒化法 的比较：,(2) 按培养器的级数分单级连续培养器和多级连续培养器 多级连续培养以单级连续培养为基础，主要用于产物生产与菌体生长不平行的培养类型上,4、连续培养的实践意义： (1)连续培养的优点： 高效、低耗、利于自控、产品质量稳定。 (2) 连续培养的缺点： 菌种易于退化、易遭杂菌污染、营养物利用率较低。,5、连续发酵： 连续培养如用于发酵工业中，就称为连续发酵。 连续发酵的特点： 优点： 自控；高效；产品质量较稳定；节约了大量动力、人力、水和蒸汽，使水、汽、电的负荷减少。 缺点： 菌种易于退化；容易污染；营养物的利用率低于分批培养。,（三）微生物的高密度培养,

19、High Cell-Density Culture 一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上的生长状态或培养技术 基因工程菌生产（E. coli）生产多肽类药物 高密度培养的意义与进展 提高产物的比生产率 高密度培养的方法 最佳培养基成分及相应最佳含量 补料 溶解氧的浓度 防止或去除有害代谢产物,一、营养物质 二、温度 （一）微生物的生长温度生长温度三基点 即微生物的最低生长温度、最适生长温度、最高生长温度。,第三节 影响微生物生长的主要因素,最适生长温度： 某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。,青霉素生产的四阶段控制，根据不同生理代谢过程的温度特点，比30恒温提高

20、14.7% 0hr5hr 30：生长 5hr40hr 25 ：发酵 40hr-125hr 20 ：累积代谢产物 125hr-165hr 25 酸奶生产 菌种培养 乳酸链球菌最适温度，34 发酵剂与酸奶发酵 抑制杂菌，用45 生产后期 产香，4 -8,（二）按生长温度划分的微生物类型 (1) 低温微生物 存在于两极地区的水域、土壤及海洋深处、腐败的冷藏食物中。专性低温菌最适生长温度为1518 ，兼性低温菌最适生长温度为2530。 (2) 中温微生物 绝大多数微生物属中温微生物，最适宜于 2040之间。 (3) 高温微生物 常见于温泉、堆肥及其他腐烂有机物中，适宜4550以上温度生长。,（三）温度

21、对微生物的影响： 1、温度对微生物生长的影响具体表现在： 影响酶活性，最终影响细胞物质合成； 影响细胞质膜的流动性，从而影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌； 影响物质的溶解度，最终影响微生物的生长。 2、低温对微生物的影响： (1) 在高于冰点的低温条件下，中温及高温微生物体内的大量饱和脂肪酸会凝固，造成生长代谢停止，而低温微生物仍能生长繁殖； (2) 在低于冰点的低温条件下，细胞内水分冻结、生化反应停止，细胞因冰晶形成而脱水，同时冰晶对细胞膜造成物理损伤，从而导致微生物死亡。,3、高温对微生物的影响 机理 蛋白质和核酸等变性、破坏，致使酶失活 参与新陈代谢的物质失活 热对微生物的致死作用 在

22、一定的温度条件下，以作用时间为横坐标，残存的活细胞数为纵坐标，可得到微生物细胞在高温作用下的死亡动力学规律,4、影响微生物对热抵抗力的因素 ： 菌种：嗜热菌的抗热力大于嗜温菌和嗜冷菌，芽孢大于非芽孢菌，球菌大于非芽孢杆菌，革兰氏阳性菌大于革兰氏阴性菌，霉菌大于酵母菌，霉菌和酵母的孢子大于其菌丝体。 菌龄 ：对数生长期的菌体抗热力较差，而稳定期的老龄细胞较强 。 菌体数量：菌数愈多，抗热力愈强 。 基质的因素： 水、脂肪、糖、蛋白质等物质含量、pH值。 加热的温度和时间 ：加热的温度越高，微生物的抗热力越弱，越容易死亡，加热的时间越长，热致死作用越大。,二、氧： （一）按对氧的需求划分的微生物类

23、型 根据氧与微生物生长的关系可将微生物分为好氧、微好氧、耐氧、兼性厌氧和专性厌氧五种类型 。,（1)专性好氧菌： 在正常大气压下进行好氧呼吸产能，细胞含SOD和过氧化氢酶，包括绝大多数真菌和许多细菌、放线菌。 （2) 微好氧菌： 只能在较低的养分压（0.010.03巴，正常大气压为0.2巴）下才能正常生长的微生物，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。 （3) 兼性厌氧菌： 在有氧或无氧条件下都能生长，但有氧的情况下生长得更好；有氧时进行呼吸产能，无氧时进行发酵或无氧呼吸产能；细胞含SOD和过氧化氢酶。包括许多酵母菌和不少细菌。,（4) 厌氧菌: 只能在无氧条件下才能生长的微生物，其生命活动所需

24、能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。常见的有梭菌属、梭杆菌属、拟杆菌属等。 （5） 耐氧菌： 一类可在分子氧存在时进行厌氧呼吸的厌氧菌，即它们的生长不需要氧，但分子氧存在对它也无毒害。它们不具有呼吸链，仅依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但没有过氧化氢酶。通常的乳酸菌属于耐氧菌。,（二）氧对微生物的影响：,通过代谢产生的超氧基化合物的毒害作用；细胞氧化还原电势的改变导致机体内正常的代谢过程不能进行；还原性烟酰胺核苷酸类物质浓度降低。 生物去除超氧阴离子自由基等各种有害的活性氧的机制：,三、pH 1

25、、微生物的生长pH： (1)不同的微生物都有其生长的pH范围，即最高、最适与最低三个数值,微生物 最低pH 最适pH 最高pH 细菌 3-5 7.0-8.0 8-10 酵母菌 2-3 3.8-6.0 7-8 霉菌 1-3 4.0-5.8 7-8,（2）不同微生物有不同的最适pH： 真菌在酸性范围内，细菌在中性偏碱范围内，放线菌在碱性范围内。,（3）同种微生物在不同生长阶段和不同的生理生化过程有不同的最适pH。 Aspergillus niger黑曲霉 2.02.5：有利于合成柠檬酸 2.56.5：菌体生长 7：合成草酸 Clostridium acetobutylicum丙酮丁醇梭菌 5.57

26、.0：菌体生长繁殖 4.35.3：丙酮丁醇发酵 （4）微生物细胞内的pH多接近于中性。因此胞内酶的最适pH也接近于中性，而位于周质空间的酶和分泌到细胞外的胞外酶的最适pH则接近环境pH。,2、按生长pH划分的微生物类型 (1)最适生长pH偏于碱性范围内的微生物 1)嗜碱微生物： 2)耐碱微生物： (2) 最适生长pH偏于酸性范围内的微生物 1)嗜酸微生物： 2)耐酸微生物： 3、pH对微生物生长的影响： (1)pH的改变使蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生改变，从而影响其生物活性； (2)pH会引起细胞膜电荷变化，导致微生物细胞吸收营养物质的能力改变； (3) pH会改变环境中营养物质的可给

27、性及有害物质的毒性。,4、对微生物生命活动过程中pH的控制 (1)微生物生命活动中pH的改变 1）糖类和脂肪代谢产酸； 2）蛋白质代谢产碱； 3）其他物质代谢产生酸碱。,(2)pH的控制：,“治标”：指根据表面现象而进行直接、及时、快速但不持久的表面化调节。 “治本”：指根据内在机制而采用的间接、缓效但可发挥持久作用的调节。,四、 水分活度（Aw） Aw 食品在密闭容器中的水蒸气压（P）与在相同温度下的纯水蒸气压（P0）之比值。 由于纯水中加入溶质后，溶液中分子之间的引力增加，冰点下降、沸点上升、蒸气压下降，且溶液中溶质越多，蒸气压下降越低，故PP0， 因此：Aw纯水=1，Aw无水食品=0 一

28、般食品的：0Aw1,1、不同类群微生物的生长和水分活度的关系 细菌生长所需的水分活性比酵母菌、霉菌高 一般在0.900.99之间，G+球菌G- 如金黄色葡萄球菌可在0.86以下生长 一般食品腐败菌生长的最低Aw在0.940.99之间 芽孢萌发时要求的水分，比营养体所要求的水分高 水分活度影响微生物的生长速度和最终的生长量,三类微生物的生长要求,2.Aw对微生物生长的影响 酵母菌生长的水分活度 酵母菌生长所需的水分活度比细菌低，比霉菌高，在0.880.94之间 霉菌生长的水分活度 多数霉菌生长所需的Aw最低为0.80，但在0.65时，尚有少数干性霉菌生长。当Aw低于0.64时任何霉菌都不能生长。

29、 干燥便成为一种很好的食品保藏方法。,3.不同食品的水分活性 新鲜食品原料 包括动物性原料和植物性原料，如鱼、肉、水果、蔬菜，均含有较多的水分，虽原料的种类不同，但其Aw多数在0.980.99之间，适宜于多种微生物尤其是细菌生长。 干制食品 0.800.85适宜于霉菌生长，其保藏期12周， 0.72，保藏期为三个月， 0.65时保藏期为13年（如奶粉）,五、渗透压 1、渗透压对微生物的影响 膜内外渗透压相等：细胞正常生长 膜内膜外（低渗透压环境）：细胞吸水膨胀 膜外膜内（高渗环境）：脱水、质壁分离,2、微生物对渗透压的适应性 绝大多数微生物可以在0.850.9%NaCl的较低溶质浓度的条件下生

30、长，有些微生物必须在含2%以上的盐浓度条件才能良好生长，称为嗜盐性微生物。 不同类群的微生物对盐的耐受力不同，但1825%的盐浓度才能完全抑制微生物的生长。 绝大多数细菌不能在较高渗透压食品中生存，多数霉菌，少数的酵母菌能耐受较高的渗透压。 采用盐渍（530%食盐）或蜜饯（3080%糖）等方式，利用高渗条件可保存食品。,六、辐射 指通过空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一个地方的能量。 七、超声波 超声波（频率在20000赫兹以上）具有强烈的生物学作用。,第四节 微生物培养法概论 一、微生物培养装置应满足以下条件： 1、提供丰富而均匀的营养物质； 2、能保证微生物获得适宜的温度和

31、对绝大多数微生物所必需的良好通气条件(只有少数厌氧菌例外)； 3、为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染。,二、微生物培养技术发展的特点： 1、从少量培养发展到大规模培养； 2、从浅层培养发展到厚层(固体制曲)或深层(液体搅拌)培养； 3、从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主； 4、从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养； 5、从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养； 6、从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团； 7、从单纯利用微生物细胞到大量培养、利用高等动、植物细胞； 8、从利用野生菌种发展到利用变异株以及“工程菌”； 9、从单菌发酵发展到混菌发酵； 1

32、0、从低密度培养发展到高密度培养； 11、从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制的自动发酵罐。,三、培养方法 （一）根据培养时是否需要氧气: 1、好氧培养：也称“好气培养”。 微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。,2、厌氧培养：也称“厌气培养”。 微生物在培养时，不需要氧气参加。 a.降低培养基中的氧化还原电位：常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养基中，便可达到目的。 b.化合去氧： 用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混合培

33、养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。 c.隔绝阻氧： 深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。 d.替代驱氧 : 用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混和气体驱代氧气。,（二）根据培养基的物理状态: 1、固体培养： 2、液体培养：,四、实验室培养法 （一）固体培养 1、好氧菌的培养： 主要有试管斜面、培养皿琼脂平板及较大型的克氏扁瓶、茄子瓶等的平板培养方法。 2、厌氧菌的培养： 培养厌氧菌除了一是需要特殊的培养装置，二是还要配制特殊的培养基。在这种培养基里，除了要满足六种营养要素外，还要加入还原剂和氧化还原势的指示剂。

34、 （1）高层琼脂柱： 用加有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，以培养相应的厌氧菌。,（2）厌氧培养皿： 1）Brewer皿：利用皿盖去创造一个狭窄空间，加上还原性培养基的配合使用而达到无氧培养的目的。 2）Spray皿或Bray皿：利用皿底有两个相互隔开的空间，其中之一故焦性没食子酸，另则放NaoH溶液，待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后，立即密闭之。经摇动，使焦性没食子酸与NaoH溶液接触，发生吸氧反应，从而造成无氧环境。,（3）亨盖特（Hungate）滚管技术 （4）厌氧罐技术： （5）厌氧手套箱技术：,厌氧培养设备,添加刃天青后的培养基放置3天后,厌氧手套箱,(二)液体培养 1、好氧

35、菌的液体培养： 在进行液体培养时，一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率，具体措施有： 浅层液体培养； 利用往复式或旋转式摇床对三角瓶培养物作振荡培养； 在深层液体培养器的底部通入加压空气，并用气体分布器使其以小气泡形式均匀喷出； 对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上设置阻挡装置。,具体方法 ： （1）试管液体培养： 装液量可多可少。此法的通气效果一股均不够理想，仅适合培养兼性厌氧茵。 （2）三角瓶浅层培养： 在静止状态下，三角瓶内的通气状况与其中装液量和棉塞通气程度对微生物的生长速度和生长量有很大的关系。此法一般也仅适宜培养兼性厌氧茵。 （3）摇瓶培养： 又称振荡培养。

36、即将三角瓶内培养液用8层纱布包住瓶口，以取代一般的棉花塞（利于通气和防止杂菌污染），同时降低瓶内的装液量，把它放到往复式或旋转式摇床上作有节奏的振荡，以达到提高溶氧量的目的。此法目前仍广泛地用于菌种的筛选以及进行生理、生化和发酵等试验中。 （4）台式发酵罐：,2、厌氧菌的液体培养： 有机还原剂：巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C或疱肉（牛肉小颗粒）等) 无机还原剂：铁丝等 氧气隔绝措施：封以凡士林石蜡层,五、生产实线中的微生物培养装置 （一）固态培养法 1、好氧菌的曲法培养： （1）原理： 将接过种的固体基质薄薄地摊铺在容器表面，这样，既可使微生物获得充分的氧气，又可让微生物在生长过程中产生的热量及

37、时释放。 （2）曲的构成 ：,（3）曲的种类： 瓶曲、袋曲、盘曲、帘子曲、转鼓曲、通风曲等。,2、厌氧的堆积培养法： 白酒生产中的大型深层地窑堆积式固体发酵。 (二) 液体培养法 1、好氧菌的培养 （1）浅盘培养： 用较大型的盘子对微生物进行浅层液体静止培养。 （2）深层液体通气培养： 发酵罐 发酵罐结构： 钢质圆筒形直立容器，有扁球形的底和盖，其高与直径之比一般为1：22.5，还有一套必要的附属装置。,主要作用： 为微生物提供丰富而均匀的养料，良好的通气和搅拌，适宜的温度和酸城度，并能确保防止杂菌的污染。 2、厌氧菌大规模的液体培养装置,发酵罐,瑞士比欧公司小型发酵罐,中试发酵罐,第五节 有

38、害微生物的控制,（一）抑制和杀灭： 抑制是在亚致死剂量因子作用下导致微生物生长停止，但在移去这种因子后生长仍可以恢复的生物学现象。 杀灭是在致死剂量因子或在亚致死剂量因子长时间作用下，导致微生物生长能力不可逆丧失，即使这种因子移去后生长仍不能恢复的生物学现象。,一、几个基本概念,（二）灭菌：杀死所有微生物。 灭菌是指采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物（包括芽孢和营养体）永远丧失其生长繁殖能力的措施。灭菌后的物体不再有可存活的微生物。 商业灭菌： 指食品经过杀菌处理后，按照所规定的微生物检验方法，在所检食品中无活的微生物检出，或者仅能检出极少数的非病原微生物，但它们在食品保藏过程中，

39、是不可能进行生长繁殖的，这种灭菌要求就叫做商业灭菌。 （三）消毒：杀死一切病原微生物。 消毒是利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施，它可以起到防止感染或传播的作用。具有消毒作用的化学物质称为消毒剂 。,（四）防腐：利用理化因素抑制微生物生长繁殖。 防腐是在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物腐败或防止其他物质霉变。具有防腐作用的化学物质称为防腐剂。 1、低温： 2、缺氧： 3、干燥： 4、 高渗透压 ： 5、高酸度： 6、高醇度： 7、加防腐剂： （五）化疗 ： 利用具有选择毒性化学药物或抗生素来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借

40、以达到治疗的一种措施。,二、物理消毒灭菌法： (一)高温灭菌的种类,1、干热灭菌法 （1）原理： 干热可使破坏细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥，并可使各种细胞成分发生氧化变质。 （2）应用范围： 1）烘箱内热空气灭菌法（150170，12hr）：金属器械、洗净的玻璃器皿。 2）火焰灼烧法：接种环、接种针等。,2、湿热灭菌： 即以100以上的加压蒸气进行灭菌。 （1）相同温度及相同作用时间下，湿热灭菌法比干热灭菌法更有效： 湿热空气穿透力强，能破坏维持蛋白质空间结构和稳定性的氢键，能加速其变性。,（2）种类： 1)常压法 a.巴氏消毒法： 用较低的温度处理牛乳或其他液态食品，杀死其中可能存在的

41、无芽孢病原菌而又不损害营养与风味的消毒方法。 a)低温维持法(LTH)：要求62.8保持30min； b)高温瞬时法(HTST)：要求71.7维持至少15s； b.煮沸消毒法： a)适用范围：一般用于饮用水的消毒。 b)条件：100下数分钟。 c.间隙灭菌法：又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。 a) 适用范围：适用于不耐热培养基的灭菌。 b) 条件：80 100下蒸煮1560分钟，保温过夜，三天。,2) 加压法： a.常规加压法 a) 适用范围： 适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。 b) 条件： 121(压力为lkgcm2)，时间维持1520分钟，也

42、可采用在较低的温度(115，即0.7kgcm2)下维持35分钟的方法。 b.连续加压灭菌法：在发酵行业里也称“连消法”。 a) 适用范围： 在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。 主要操作是将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。 b) 条件：在135140下处理5 l 5秒钟。,c) 连消法的优点： 因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率 ；, 由于总的灭菌时间较分批灭菌法明显减少，所以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率； 由于蒸汽负荷均匀故提高了锅炉的利用率； 适宜于自动化操作； 降低了操作人员的劳动

43、强度。,(3) 利用温度进行灭菌的定量指标： 1）热死时间 指在某一温度下，杀死某微生物水悬浮液群体所需的最短时间。 2）热死温度： 又称热死点，指在一定时间内（一般为10min），杀死某微生物水悬浮液群体所需的最低温度。 3）D值 利用一定温度进行加热，活菌数减少一个对数周期（即90%的活菌数被杀死）时，所需要的时间（分）。测定D值时的加热温度，即在D的右下角表明。,4）Z值 如果在加热致死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90%的加热时间）所需要升高的温度数。这所需要升高的温度数，即为Z值。 5）F值 ： 在一定的基质中，其温度为121.1，加热杀死一定数量微生物所需要的时间（分），即为

44、F值。,(4)影响加压蒸汽灭菌效果的因素： 1)灭菌物体含菌量的影响；,2)灭菌锅内空气排除程度的影响；,3)灭菌对象pH的影响； pH6.0一8.0时，微生物较不易死亡；pH6.0时，易引起微生物死亡。,4)灭菌对象的体积； 体积大小影响热传导速率 5)加热与散热速度 上磅速度：达到压力所需要的时间 下磅速度：从规定压力降到零的时间 维持时间,(5)高温对培养基成分的有害影响及其防止： 1)有害影响；,2)消除措施； a.采用特殊加热灭菌法； 分别单独灭菌、低压灭菌、间歇灭菌 a) 对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并； b) 对含ca2+或Fe3+的培养基与

45、磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀； c) 对含有在高温下易破坏成分的培养基可进行低压灭菌(在112即0.57kgcm2或8磅英寸2下灭菌15分钟)或间歇灭菌； d) 在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌。,b. 过滤除菌法： 各种滤器 滤膜过滤装置、烧结玻璃板过滤器、石棉板过滤器、素烧瓷过滤器、硅藻土过滤器 缺点：无法去除病毒和噬菌体 c.其他方法。 避免发生沉淀： EDTA（乙二胺四乙酸）NTA（氮川三乙酸） 气体灭菌剂：氧化乙烯,（二）过滤除菌：适用于血清、抗生素及糖液等的除菌。,过滤除菌,（三）辐射灭菌： 紫外线、放射性同位素、微波等。,三、化学消

46、毒灭菌法 是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。 （一）影响消毒与灭菌的因素： 1、化学药品及浓度的高低； 2、处理微生物的时间长短； 3、微生物的种类； 4、微生物所处的环境。,（二）消毒灭菌效果的评价： 1、石炭酸系数(p.c.) 评价表面消毒剂的相对杀菌强度 指在一定时间内，被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度之比。 2、最低抑制浓度（MIC）评定某化学药物药效强弱 指在一定条件下，某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度。 3、半致死剂量（LD50）评定某化学药物毒性强弱 指在一定条件下，某化学药物能杀死50%试验动物时的剂量。 4、最低致死剂量

47、（MLD）评定某化学药物毒性强弱 指在一定条件下，某化学药物能引起试验动物群体100%死亡率的最低剂量。,（三）常用的化学杀菌剂或制菌剂,1、表面消毒剂： 指对一切活细胞都有毒性，不能用做活细胞内的化学治疗用的化学药剂。 理想的消毒剂：杀菌力强，使用方便；价廉；对人、畜无害；能长期保存；溶解度大；无腐蚀性等。 消毒剂种类：氧化剂、重金属盐、有机化合物,2、化学治疗剂： 能直接干扰病原微生物的生长繁殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物称为化学治疗剂。 (1)抗代谢药物 1) 什么是抗代谢药物？ 又称代谢拮抗物、代谢类似物，是指在结构上与生物体所必需的代谢物相似，可以与正常代谢途径中特定的酶发生竞争

48、性反应，从而阻碍酶的功能、干扰代谢的正常进行的物质。 2) 抗代谢药物的种类 磺胺类、氨基叶酸、异烟肼、6-巯基腺嘌呤、5-氟代尿嘧啶。 3) 抗代谢药物的三种作用 竞争酶的活性中心 假冒正常代谢物 代谢途径终产物结构类似物的反馈调节,4）抗代谢药物的代表磺胺类药物的作用机制： 磺胺的作用机制： 磺胺是细菌的生长因子对氨基苯甲酸（PABA）的结构类似物，它可以与细菌叶酸合成途径中的二氢蝶酸合成酶发生竞争性反应，生成“假二氢叶酸”，使细菌的叶酸无法正常合成，从而抑制其生长。 磺胺增效剂三甲基苄二氨嘧啶TMP的作用机制： TMP能抑制细菌叶酸合成途径中的二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸无法还原成四氢叶酸，从而增强磺胺的抑制效果。, 磺胺具有高度选择毒力的原因 磺胺类药物是氨苯磺胺衍生物，其结构与对氨基苯甲酸（PABA）类似，而PABA是叶酸分子组成。叶酸是辅酶，在氨基酸、维生素合成中起重要作用，许多细菌需自己合成叶酸，而人和动物无二氢蝶酸合成酶、二氢叶酸合成酶和二氢叶酸还原酶，只能利用现成叶酸，因此不受磺胺干扰。,如何解释磺胺药物的降效和失效现象,磺胺药物与PABA浓度关系 外源PABA、二氢蝶酸、二氢叶酸、嘌呤、嘧啶、核苷酸、丝氨酸、甲硫氨酸 基因突变,(2) 抗生素 1) 定义 抗生素是生物在其生命活动中产生的一种次生代谢产物或其人工衍生物，能对他