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1、第十章 植物原生质体培养和细胞融合,10.2 原生质体融合,10.1 植物原生质体培养,主要内容,原生质体（protoplast）：是去除细胞壁的裸露植物细胞。 原生质体培养再生植株技术是细胞融合（cell fusion）和体细胞杂交（somatic cell hybridization）基础。,第一节 植物原生质体培养 一、设备与工具 除了需要组织培养的设备和工具之外，还需要一些用具。 1、倒置显微镜 荧光显微镜 反照相设备 普通显微镜：原生质体或细胞培养密度（采用血球计数板） 倒置显微镜：观察培养皿、培养瓶或滴瓶中的培养物 荧光显微镜：检查原生质体活性及去壁情况,2、细菌过滤器 0.45m
2、的滤膜可以滤去细菌和病毒 （1） 可用抽滤瓶接真空泵抽滤灭菌 （2） 可用注射器推压过滤灭菌 3、离心机 提纯原生质体500r/min离心3-5min 制备酶液用2500r/min离心10min,二、 化学试剂 1、无机化学试剂：分析纯 2、有机化学试剂： 维生素：组织培养常用的维生素以外还需泛酸钙，叶酸，VA，VC，VD，生物素，氯化胆碱，对甲基苯甲酸 激素：生长素和细胞分裂素的适当搭配 渗透压稳定剂：糖醇系统（ 甘露醇，山梨醇，葡萄糖，蔗糖） 碳源和氮源：C源：葡萄糖和蔗糖；N源：水解酪蛋白，谷氨酰胺，甘氨酸，Arg，Asp 3、凝胶剂：琼脂粉、琼脂糖、日本的Gelloan Gum,三、
3、酶类 纤维素酶：日本的Cellulase onzuka R10 Cellulase onzuka Rs 美国 Cellulysin 果胶酶：日本的Pectolyase Y23 Macerozyme 美国Pectinase,四、原生质体的分离与纯化 1、外植体的选择 生长旺盛的植物体幼嫩部分 外植体有根、下胚轴、幼叶、子叶 选择处于对数生长早期的细胞或愈伤组织 酶解游离原生质体之前对植株进行预处理 （暗处理、低温处理、组培的培养基上培养）,2、外植体灭菌：跟组培一样 3、酶处理 静置在黑暗中进行 时间：几小时到十几小时 温度：25-27,4、原生质体的收集和纯化 收集：用40-100m的滤网过滤
4、混合液，将滤液以台式离心机75-100g离心3-5min。,纯化： 沉淀物重新悬浮于清洗培养基中，在50g离心3-5min后再悬浮，如此反复洗涤2-3次。 为了纯化出有活力的原生质体，将沉淀悬浮于少量清洗培养基，置于含有蔗糖溶液（21%）的上部，在100g下离心5-10min后，在蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上会出现一个纯净的原生质体带，将此带吸收后，再反复洗涤2次，最后用原生质体培养基洗一次。,五、原生质体培养 1、培养基 D2a（适用于茄科、玄参科、豆科、藜科） D2b（除去D2a培养基中的葡萄糖并及时补充蔗糖） 一般情况下：无机盐的大量元素含量稍低，钙离子含量较高，采用有机氮源而少
5、用铵盐 激素：1-2mg/l 2.4-D或配以浓度0.20.5mg/l玉米素,2、培养方法 （1）液体培养 微滴培养：将悬浮的密度为10000100000个/ml原生质体的培养液用滴管以0.1ml左右的小滴一滴一滴地接种到培养皿上，如果将培养皿翻转过来，则成为悬滴培养。 浅层培养：将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。,（2）固体培养：原生质体悬液体+热融的含琼脂的培养基在45下等量混合。 （3）固液体混合培养：在培养皿底部先铺上一层琼脂培养基，待固化后，在固体培养基表面再作浅层液体培养。,3、培养条件 保持湿度是培养的关键因子 各种植物原生质体要求不同的最适温度，一般可在25上下。在光
6、照方面，多数原生质体适合在暗淡的散射光下或黑暗中生长。 原生质体培养要求有较高的密度，具体密度因植物材料、物种及基因型不同而异。 原生质体培养了一段时间后，要添加新鲜培养基，并且通过用较低渗透压的细胞培养基代替，以便适应新细胞团或愈伤组织的生长。,4、原生质体的发育 原生质体在适合的条件下，首先形成新的细胞壁，继而进行分裂，形成愈伤组织。 5、 原生质体植株再生 途径： （1）将原生质体再生的愈伤组织直接转移到分化培养基上，一步成苗。 （2）先将愈伤组织培养在含细胞分裂素和低浓度2.4-D的分化培养基上，形成质地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，再将其转到含细胞分裂素的分化培养基上再生植株。,第二节
7、 原生质体融合（体细胞杂交） 一、细胞融合的方法 自发融合（Spontaneous Fusion）：在溶解细胞壁过程中，有些原生质体能彼此融合形成同核体。 诱导融合（induced fusion）：用物理或化学的方法来诱导原生质体的融合。步骤：两个或多个原生质体的质膜彼此靠近，局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，融合完成，形成球形的异核体或同核体。,融合方法： 1）物理方法（电融合） 2）化学方法 NaNO3处理（异核体形成频率不高） 高pH-高钙处理方法：pH在10.5、50mmol/L CaCl2 H2O 37处理原生质体（杂种产量高，但对细胞有毒） 聚乙二醇处理方法：异核体形成频率高，可重复
8、性强 ，毒性低。,二、细胞融合的程序 两种亲本的原生质体分离：由双子叶植物中分离出的原生质体是良好的材料。 原生质体融合 1）非对称杂交：一方亲本的细胞核和细胞质分另一方亲本的少量核物质和全部细胞质融合 2）细胞质杂交：一方亲本的细胞核和细胞质及另一方的亲本的全部细胞质融合。,方法： $一个正常的原生质体 + 一个去核的原生质体 $一个正常的原生质体+ 一个核失活原生质体融合 $异核体形成之后2个核中有一个消失 $在较晚的时期chr选择型地消除,三、异核体或杂种细胞的选择 方法： 互补选择法：融合后的细胞要进行两次不同的培养条件的培养。适用于缺失体、某些营养缺陷型、抗某些因子的亲本。 机械分离
9、法：不常用,四、杂种细胞或杂种植株的鉴定 1、形态学分析 2、细胞学分析（染色体的计算及形态观察） 3、生物化学或分子生物学分析： 同工酶谱分析 RuBp羧化酶分析和Fraction分工蛋白分析 叶绿体DNA，线粒体DNA，核DNA的分析 采用Southern杂交和RFLD图谱分析 4、抗型分析：检查某些抗型性状 5、育性分析：检查花粉,在酶液消化过程中，由于实验材料的个体差异，酶解时间不固定。因此要用显微镜随时检查酶解情况,本章要点 1、掌握原生质体的分离纯化和培养方法。 2、掌握原生质体融合或体细胞杂交方法和程序。,作业题 简述酶法分离原生质体的原理和步骤？ 如何分离纯化植物原生质体并鉴定其活力？ 原生质体培养有何特点？ 原生质体融合有哪几种主要方法？ 如何进行细胞杂种的选择和鉴定？,