第四章DNA复制王赟.ppt

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1、,DNA复制,DNA复制可能的三种方式,由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验的被誉为生物学最美丽的实验,半保留复制实验,亲代DNA,； 15N标记,在15N标记培养基中培养：,15N标记DNA移到14N标记DNA培养基中,氯化铯密度梯度超离心,15N,DNA在14N DNA培养基中培养第1.n代,亲代,F1,F2,Fn,Meselson 和Stahl的证明DNA半保留复制的实验流程,Meselson 和Stahl的实验结果,Meselson与Stalh在42年以后在最初他们相遇的一颗树下重逢时的合影,半保留复制的实验结果,15N,DNA显示为一条重密度带位于离心管的管底。,1

2、5N,DNA和14N -DNA的杂交分子中密度带。, 第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明,它们分别为15N 14N DNA和14N -DNA。, 在14N培养基中培养代数的增加，低密度带增强，,而中密度带逐渐减弱。,半保留复制进一步的实验证椐,15N,DNA、14N DNA杂交分子经加热变性，对于,变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。, 结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后,则分为两条区带，即重密度带(15N DNA)及低密 度带(14N DNA)。,15N,DNA第一代变性前后超离心,15N,DNA第一代：,变性前,变性后,排除了弥散复制,Taylor以蚕豆根尖细胞为

3、材料、使用放射性同位素证明真核细胞DNA也是半保留复制的实验。,DNA的半保留复制,两条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，子代,DNA 分子中一条链来自亲代DNA ，另一条链是新 合成的，这种复制方式称为半保留复制。,某些生物DNA复制的引物序列,证明DNA复制的方向始终是53的末端终止实验,DNA复制起始区的特征,由多个短的重复序列组成； 能够被多亚基的复制起始区结合蛋白识别； 通常富含AT碱基对，这有利于DNA复制起动时的解链，因为AT碱基对含有的氢键数目低于GC碱基对。,DNA复制起始区的特征,电镜下真核生物DNA的多个复制叉结构,复制叉的结构,当DNA复制从起始区起动的时候，起始区

4、的DNA双链因发生解链而形成叉状结构，这样的结构被称为复制叉,真核生物DNA复制子,Cairns的实验,复制开始时，将大肠杆菌放在含低剂量的3H-dT的培养基中培养几分钟；随后，将细菌转移到含高剂量的3H-dT的培养基中继续培养一段时间；最后，收集细胞，小心地裂解以抽取其中的染色体DNA进行放射自显影。如果是单向复制，自显影图谱上银颗粒的密度应该是一端高、一端低；如果是双向复制，则应该中间是一段低密度的银颗粒，两侧是高密度的银颗粒。低密度银颗粒意味着这一段DNA属于复制起始区，高密度颗粒代表的是后来合成的。,Cairns证明大肠杆菌DNA双向复制的实验,Reiji Okazaki的实验,脉冲标

5、记目的在于即时标记在特定时段内合成的DNA。 和脉冲追踪目的则是要弄清那些被标记上的DNA片段后来的去向。,Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验,脉冲标记,在培养时，培养基中加入同位素3H标记的dTTP，经30秒后，DNA刚开始复制，分离DNA，然后在碱中沉淀，变性，让新合成的单链和模板链分开，再用CsCl密度梯度离心，以沉降的快慢来确定片段的大小，再检测放射标记，结果表明被3H标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为20S左右，即都是长10002000Nt的DNA片段，而亲本链要比它大2050倍；,脉冲追踪,这个实验是先进行标记培养30秒，以后除去同位素继续培养几分钟，再分离DNA在碱

6、中沉淀，检测结果。先合成的（带标记）的DNA不再是短片段，而和总DNA的情况相似，沉淀系数为70S120S较长的片段，这意味着刚开始合成的片段都是短片段，以后再连接成长片段，人们就把最初合成的短片段称为冈崎片段（Okazakifragment）,Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析,不连续复制,由于这个实验的结果使得人们普遍认为： 无论是前导链还是后滞链都是先合成小片段， 然后在连成大片段，称为“不连续复制“ （discontinuousreplication）,在复制叉中不连续合成的DNA片段称为冈崎片段，连续合成的DNA子链被称为前导链，不连续合成的DNA子链被称为后随链或滞后

7、链。,1978年Olivera提出了半不连续（semidiscontinuous）复制模型， 也就是说前导链上的合成是连续的，只有后滞链上的合成才是半连续的。,由于细胞内都存在有dTTP和dUTP，而DNApol却并不能区分它们，因此也会将dUTP加入到DNA中，形成AU对。那么在DNA中为什么没有U的存在呢？这是因为E.coli细胞里有双重“保险”，防止了U的“混入”。 第一道关是细胞里的dUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。但总还有些漏网之“鱼”，它们还是逃过此关，混入DNA中，这就靠第二道关来清除“异己”，这道关的主角

8、是尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinicorapyrimidinic，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。在细胞内尿嘧啶N-糖苷酶作用较快，而AP酶作用较慢，在新链合成之初约1200bp就有可能掺进一个U，但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切断糖苷键，在AP酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了，用NaOH沉淀时，AP位点十分易断裂，所以前导链也成了小片段。,复制的速度和方向,DNA复制过程的三个阶段, DNA复制的起始阶段，包括起始点，复制方向以,及引发体的形成。, DNA链的延长，包括

9、前导链及随从链的形成和切,除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。, DNA复制的终止阶段。,（一）DNA复制的起始阶段, 复制是从DNA分子上的特定部位开始的，复制起始点,(originof replication)常用ori或o表示，称为复,制子或复制单元(replicon)。, 在原核细胞中只有一个复制起始点，一个复制子。, 在真核生物中复制是从许多起始点同时开始的，即,有多个复制子。,1、DNA复制起始点的结构特性, 大肠杆菌Ori由422个核苷酸组成，是一系列对称排,列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)。, 有些生物复制起始点Ori是富含AT的区段。这些特,殊的结构对于

10、在DNA复制起始过程中参与的酶和许,多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。,2、DNA复制的方向性, 定点开始双向复制：, 定点开始单向复制：,两点开始单向复制：,ori,3、DNA复制的起始, DNA双螺旋的解旋由多种酶来完成的, DNA解链酶：水解ATP获能解开双链DNA, 单链结合蛋白（SSB蛋白）：保持单链结构, RNA聚合酶：合成RNA引物, 对于随从链是由引发体来完成的，引发体由6种,蛋白组成：n、n/、n / / 、DnaB、C、I,（二）DNA链的延长, DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合,酶作用下，将四种dNTP聚合成DNA的过程。, 需要许多种酶和蛋白质参与。,

11、1、DNA聚合酶, 1957年，Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现,DNA聚合酶简写DNA pol，后来又相继发现了,DNA聚合酶和DNA聚合酶。, 大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNA pol起作,用，而DNA pol和DNA pol在DNA错配的校正,和修复中起作用。,真核生物DNA聚合酶, 真核生物DNA聚合酶有、及。复制,中起主要作用的是DNA pol。, 与DNA修复有关。, 在线粒体DNA的复制中起作用。, 前导链合成靠催化，还需要调节因子参与。, 随从链的合成靠和引发酶配合作用完成。,DNA聚合酶的性质, 需要DNA模板, 需要RNA做为引物, 催化dNTP加到

12、引物的3-OH末端, DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和,修复过程的不同阶段发挥作用。,2、与超螺旋松驰有关的酶, 拓扑异构酶(topoisomerase)改变DNA拓扑性质的,酶，松驰超螺旋，有利于复制叉的前进合成。, 拓扑异构酶有型和型，原核、真核中均有。,（三）DNA复制的终止阶段, 大肠杆菌DNA具有复制终止位点，此处可以结合,一种特异的蛋白质分子叫做Tus，通过阻止解链 酶(Helicase)的解链活性而终止复制。,“滚环复制”,某些噬菌体（如M13和X174）DNA和一些小的质粒（如枯草杆菌内的pIM13质粒）在宿主细胞内通过滚环复制方式扩增DNA。 真核细胞的某些基因

13、，如某些两栖动物卵母细胞内的rRNA基因和哺乳动物细胞内的二氢叶酸还原酶基因，在特定的情况下会通过滚环复制在较短的时间内迅速增加目标基因的拷贝数。,滚环复制,D-环复制,线粒体和叶绿体DNA通常以D-环的方式进行复制。少数病毒，如腺病毒，也进行D-环复制 。 催化线粒体DNA复制的酶是DNA聚合酶，两条链的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成冈崎片段，因此都是连续合成。 两条子链的合成在时间上的不同步。,D环复制,干细胞分裂过程中的“不朽链假说”,干细胞的分裂是不对称的，而分裂的不对称性使以后的干细胞能够选择性得到含有最老的DNA模板的染色体。这样的假设是合乎逻辑的，因为如果一个干细胞在分裂

14、中抓住最老的DNA，就等于将复制可能产生的错误“拒之门外”，从而大大降低了细胞癌变的可能性，而将来分化成体细胞的子细胞得到易错的新DNA也没有什么危险，因为它们很快停止分裂或者死亡，特别是在高度更新的组织。,“不朽链假说”图解,原核生物DNA复制的特点,过程复杂；需要多种酶和蛋白质参与（包括拓扑异构酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及连接酶等）。,原核生物DNA复制的特点,1. DNA复制的起始,复制起始原点 DNA双螺旋的解旋 复制的引发,大肠杆菌(E. coli)的 OriC 复制原点,大肠杆菌基因组的复制原点位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操纵子之间，全长245 bp,

15、 称为oriC。,参与DNA复制起始和引发的蛋白质,DNA解旋酶(DNA helicase) 催化DNA双链的解链过程。 单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein)： 以四聚体形式存在于复制叉处，只保持单链的存在，并不能起解链作用。 DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 消除DNA双链的超螺旋堆积。 引物酶(primase) 合成一小段RNA引物，为DNA新链的合成提供3-OH末端。,1.1 解旋酶（helicase) DNA复制时，解旋酶利用ATP的能量启动DNA解旋，使双连分开形成单链。,1. DNA双螺旋的解旋,在Ecoli

16、中，解旋酶DnaB作为引发体的成员，参与复制叉形成，并结合于一个复制叉，利用ATP水解的能量解开双螺旋，推动复制叉向前延伸; 大部分DNA解链酶可沿后随链的5-3方向随着复制叉的前进而移动，Rep蛋白则沿前导链模板的3-5方向移动。 生物体内的解旋酶有多种，有些解旋酶还参与DNA修复，重组等非复制过程。,1.2 拓扑异构酶（topoisomerase) 可以使DNA的两种拓扑异构体互变的酶。 DNA分子在细胞内以超螺旋形式存在， DNA拓扑异构酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间转变。,Action of topoisomerase at the replication fork,Topoi

17、somerase rapidly remove the positive supercoils accumulate in front of the replication fork.,功能：与DNA形成共价结合中间体，使DNA磷酸二酯键断裂，形成DNA nick ，DNA的一条链进行解旋旋转而改变DNA分子的拓扑状态。 v 参与复制、转录、重组。,效应：拓扑异构酶可使DNA发生： 连环化（catenate) 脱连环化(decatenate) 打结（knot) 解结（unknot),拓扑异构酶类别,拓扑异构酶I DNA拓扑异构酶I对单链DNA的亲和力要比双链高得多，这正是它识别负超螺旋DNA的

18、分子基础，因为负超螺旋DNA常常会有一定程度的单链区。负超螺旋越高，DNA拓扑异构酶I作用越快 生物体内负超螺旋稳定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物体通过拓扑异构酶1和II的相反作用而使负超螺旋达到一个稳定状态。现已发现，编码Ecoli拓扑异构酶I的基因topA发生突变，则会引起旋转酶基因的代偿性突变；否则，负超螺旋增高，细胞生活能力降低。 拓扑异构酶II II类拓扑异构酶没有碱基序列特异性，它们可以和任何相交的两对双链DNA结合。,通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键， 然后重新缠绕和封口来更正DNA连环数的酶。,解旋酶沿着复制叉向前延伸产生了一段单链，细胞内大量的单链结合蛋白能

19、和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链。,1.3 单链结合蛋白（SSB）,SSB的作用： v 使DNA单链保持一种伸展构象，它们与磷酸骨架结合，离开暴露的碱基，此次那些碱基能作为DNA合成的模板； v 使解开的单链不形成发卡结构； v 保护DNA单链不受Dnase水解。,2 DNA复制的引发,oriC (84min),（dnaA结合位点）,此序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。,oriC在不同原核生物中有同源性，很多细菌的oriC区在结构上相似的，在序列上有相当的保守性，而且在分类上越接近的细菌其同源性越高，表明DNA复制起点的重要性。,将DNA分子的复制起始位点（复制器）连接到任何一个

20、DNA分子上，都能起始其复制。,起始蛋白与特异序列结合、促进解旋和引发体组装,引发体是由很多蛋白质因子参与形成的。,只有当引发前体把这6种蛋白质合在一起并与引发酶进一步组装后形成引发体，才能发挥其功效。,4.3.4 引发酶（Primase，或引物酶),DNA 合成时需要一段大约6-10个核苷酸长的RNA，作为DNA 合成的引物；这段引物是由引物酶合成的。 是在特定环境下发挥作用的RNA聚合酶，仅用于合成DNA复制所需的一小段RNA。 引物酶以单链DNA为模板，利用核糖核苷酸直接从头合成RNA引物（6-10nt)。,减少致死突变。 DNA合成中最初几个核苷酸正确性远比其后的低。引物RNA 随后被

21、降解，从而减少了复制错误。,引物的意义：,引物酶催化引物RNA的合成，但它不同于RNA聚合酶。 引物酶只在复制起点处合成RNA引物以引发DNA复制，而RNA聚合酶则是启动DNA转录合成RNA ，从而将遗传信息由DNA传递到RNA。,E.coli的引物酶由一条肽链组成，分子量为60KD,DnaG基因编码。, DnaA protein molecules binds to the four 9 bp repeats in the origin，then recognizes and successively denatures the DNA in the region of the three

22、13 bp repeats, which are rich in A=T pairs This process requires ATP and the bacterial histonelike protein HU. HU prevents nonspecific initiation at sites other than oriC The DnaA protein then mediates the separation of the strands of the DNA duplex by acting on three AT-rich tandem repeats located

23、at the 5-end of the sequence defining oriC Formation of this 45-bp “open complex” by DnaA protein is ATP-dependent., DnaB protein (a hexamer of 50-kD subunits) binds to the “open” oriC. DnaB protein is delivered to oriC by DnaC protein assisted by DnaT protein. The addition of DnaB protein completes

24、 assembly of the pre-priming complex（引发前体）. ATP hydrolysis drives the formation of this complex . DnaB protein has helicase activity and it further unwinds the DNA in the pre-priming complex in both directions SSB tetramers coat single stranded regions as they arise., 引物酶（）结合到引发前体上组装成了引发体（primosome

25、）。 在SSB和拓扑异构酶的参与下，引发体可在单链上移动，在的帮助下，识别复制的起始起点位置。, 引发体在复制叉先合成先导链的RNA引物，再合成后滞链的引物（Primase association with DnaB is transient; once a primer has been synthesized, primase dissociates until another round of primer synthesis is necessary.) 在复制叉DNA polymerase III 组装成非对称的二聚体，它催化第一个按碱基互补配对原则加在引物的端，而进入链的延伸阶段.

26、,DNA链的延伸需要的蛋白质:,DNA聚合酶 滑动夹（Sliding DNA clamp） RNA酶(RNase H 等) 在复制完成后切除RNA引物。 DNA连接酶 (DNA ligase) 通过生成35-磷酸二酯键连接两条DNA链。,2. DNA链的延伸,DNA polymerase use a single active site to catalyze DNA synthesis,DNA polymerase bound to a primer:template junction,palm,Processivity (持续合成能力),Processivity is a characte

27、ristic of enzymes that operate on polymeric substrates. For DNA polymerase, the degree of processivity is defined as the average number of nucleotides added each time the enzyme binds a primer:template junction (a few50,000).,Structure of a sliding DNA clamp,Sliding DNA clamps encircle the newly rep

28、licated DNA produced by an associated DNA polymerase.,Sliding clamps dramatically increase DNA polymerase processivity (持续合成能力),The composition of the DNA Pol III holoenzyme,Three enzymes: Two copies of the DNA Pol III core enzyme One copy of the -complex,The “trombone” model for coordinating replic

29、ation by two DNA polymerase at the E. coli replication fork,冈崎片段与半不连续复制,冈崎片段(Okazaki fragment)一般长约1000-2000个碱基，原核比真核长。,前导链 Leading strand 后随链 Lagging strand,然后，RNaseH降解RNA引物，DNA聚合酶I补齐缺口，再由DNA连接酶连接两个冈崎片段。,Steps in the synthesis of the lagging strand,Removal of RNA primers from newly synthesized DNA,R

30、NAse H removes all of the RNA primer except the ribonucleotide directly linked to the DNA end.,An exonuclease removes the final ribonucleotide.,DNA polymerase fills the gap, leaving a a break in the backbone between the 3OH and 5 phosphate of the repaired strand.,DNA ligase repaires this “nick”.,当复制

31、叉前移，遇到20bp重复性终止子序列(Ter)时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。,ter,3. 复制的终止,复制的终止位点,在E.coli DNA上存在着复制的终止位点; 终止位点的序列Ter (): A A T T A G T A T G T T G T A A C T A A A G T T T A A T C A T A C A A C A T T G A T T T C A,终止序列可被tus蛋白（tus基因编码）识别，并结合于其上； Ter-Tus复合物能使DnaB不再将DNA解链，使

32、复制叉停止前移； E. coli两个复制叉在相距100kb时，复制速度减慢从而协调两个复制叉到达时间。 Tus protein只让一侧复制叉通过，使DNA的复制在终点位置终止。,复制终止的协调： 在Forks meet 两侧各有几个段序列如：terE. D. A. terC. B。当一侧复制叉前进的快，而另一侧前进的慢时，快侧复制酶则会在ter位点停止，等待直到慢侧跟上。 以上似乎构成一个“replication fork trap”,E .coli DNA复制到最后，子代DNA链套在一起,由DNA拓扑异构酶II切开双链将两个DNA分子分开成为两个完整地与亲代DNA分子完全一样的子代DNA分子

33、。,DNA聚合酶I (coded by polA)不是复制大肠杆菌染色体的主要聚合酶，它有 3 5核酸外切酶活性,与DNA聚合酶的校正功能有关，保证了DNA复制的准确性。,DNA Polymerase I,它的5 3核酸外切酶活性也可用来除去冈崎片段5端RNA引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将片段连接起来。,DNA聚合酶II (coded by polB)的活性很低，只有DNA聚合酶I的5%，所以也不是复制中主要的酶。 生理功能主要是起修复DNA的作用。,DNA Polymerase II,DNA聚合酶III (coded by polC)包含有7种不同的亚单位和9个亚基，其生物活性形式

34、为二聚体。Core enzyme & holoenzyme,DNA Polymerase III,它的聚合活性较强，为DNA聚合酶I的15倍，聚合酶II的300倍。,它能在引物的3OH上以每分钟约5万个核苷酸的速率延长新生的DNA链，是大肠杆菌DNA复制中链延长反应的主导聚合酶。,全酶,DNA Polymerase III,The holoenzyme consists of: The core enzyme , The sliding clamp - The clamp loader complex A processivity switch - ,DNA聚合酶I (DNA损伤的修复）,DN

35、A聚合酶I、II、III (a proofreading activity),DNA聚合酶III,DNA聚合酶IV和V分别由dinB和umuD2C基因编码， 主要在SOS修复过程中发挥功能。,DNA Polymerase IV& V,1、都以dNTP为底物。,2、都需要Mg2+激活。,3、聚合时必须有模板链和具有 3-OH末端的引物链。,4、链的延伸都方向为53。,DNA聚合酶的共同点：,6 DNA连接酶（ligase) 催化双链DNA切口处的5-磷酸和3-羟基生成磷酸二酯键; 连接反应需要供给能量。大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶以NAD作为能量来源;动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能

36、量来源。,DNA 滞后链上的复制是不连续的，各合成的片段需要连接酶连接，连接酶的反应条件： v 被连接的两链必须与另一链（模板链）互补； v 两链相邻； v 每次只能连接一个缺口； 使一条链的5- P 与另一链的3- OH形成磷酸二酯键； 缺口缺失核苷酸不连接。,T4 Ligase 特性： v可连接DNA与DNA，也可连接RNA与RNA。 可连接DNA中的单链切口，也可连接粘性末端切口和齐末端切口。 T4 Ligase 可作为重组工具酶。,T4连接酶,T4连接酶,真核生物DNA的复制,真核生物DNA的复制特点,有多处复制起始点； 在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始；原核生物

37、起始点上可连续开始新的DNA复制。 DNA复制只在S期进行。 复制子相对较小，为40-100kb。E.coli?,真核生物的复制起始位点被称为自主复制序列(autonomous replicating sequence, ARS) 这个序列是染色体正常起始复制所必需的。 所有的ARS的DNA均有一段保守序列： （A区） -A(T)TTTAT(C)A(G)TTTA(T)-,起始点识别复合物 (origin recognition complex, ORC) DNA的复制起始需要ORC的参与 ORC结合于ARS，形成复制叉。 ORC它是由6种蛋白质组成的启动。,酵母的复制起始位点： 长约150bp

38、左右， 包括数个复制起始必需的保守区。,酵母染色体的着丝粒附近为ARS1序列,起始点识别复合物,ARS1分为A,B,C三个功能区, A,B起主要作用,C起次要作用。 A区为15bp,其中11个保守，称ACS (ARS consensus sequence)。有复制起始子的功能 B区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区。 B3是ABF1（ARS-binding factor 1）结合区，,ARS1序列特征,真核生物DNA复制叉的移动速度大约只有50bp/秒。 因此，人类DNA中每隔30,000-300,000bp就有一个复制起始位点。,已发现的真核生物DNA聚合酶有15种以上。 在哺乳动物

39、细胞中主要有5种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶、和 。,真核生物DNA聚合酶的特性比较,DNA聚合酶主要参与引物合成。,DNA聚合酶活性水平稳定，主要在DNA损伤的修复中起作用。高忠实性修复酶,DNA聚合酶主要负责DNA的复制。,DNA聚合酶与后随链合成有关，在DNA合成过程中核苷切除以及碱基的切除修复中起着重要的作用。,DNA聚合酶在线粒体DNA的复制中发挥作用。,真核生物中还存在、和等几种DNA聚合酶，它们承担着修复损伤的功能，但这些修复酶的忠实性都很低。,真核生物DNA聚合酶特征,dNTP Mg2+ 3-OH 5-3,真核生物DNA聚合酶一般不具有外切酶活性。,Key Concept

40、s, A replication fork has 1 complex of DNA polymerase /primase and 2 complexes of DNA polymerase and /or . The DNA polymerase /primase complex initiates the synthesis of both DNA strands. DNA polymerase elongates the leading strand and a second DNA polymerase or DNA polymerase elongates the lagging

41、strand.,去除冈崎片段：分两步 RNA酶H1切断DNA-RNA， FEN1蛋白降解RNA片段。 真核生物的聚合酶没有5-3外切酶活性，需要一种叫FEN1的蛋白切除5端引物 DNA连接酶I将相邻的冈崎片段连接起来,DNA末端复制,端粒(telomere) 真核生物染色体线性DNA分子末 端的结构。 结构特点： 1. 由末端单链DNA序列和蛋白质构成 2. 末端DNA序列是多次重复的富含G、C 碱基的短序列 功能：1. 维持染色体的稳定性 2. 维持DNA复制的完整性,端粒酶(telomerase) 特点： 1. 由RNA和蛋白质构成的复合物 2. 为特殊的逆转录酶，能以自身的RNA为 模板

42、逆转录合成端粒DNA 功能： 合成端粒DNA，维持端粒的长度,爬行模型：,离开RNA模板的端粒DNA3端可反折为双链，并常出现两个G 之间的配对，以有利于DNA-RNA杂交链之间的相对滑动。,端粒及端粒酶的意义：,端粒特别是端粒酶的活性与细胞的生长、繁殖、衰老凋亡以及肿瘤的发生密切相关。 端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而逐渐变短至消失，可导致染色体稳定性下降，导致细胞衰老凋亡。 体细胞几乎没有端粒酶活性，随多次细胞分裂端粒逐渐缩短，细胞失去增殖能力。而端粒酶活性较高的胚原细胞，端粒长度未缩短。 肿瘤细胞端粒酶重新获得活性，以维持端粒结构致使染色体稳定而成为永生细胞。肿瘤细胞的端

43、粒比正常人同类细胞显著缩短。,DNA复制的调控, 大肠杆菌染色体DNA的复制调控 ColEI 质粒DNA的复制调控 真核细胞中DNA的复制调控,复制的调控,许多现象表明，DNA的复制是受到调控的。 比如原核细胞在不同的生长条件下细胞的分裂速度是不同的， 举个例子： 大肠杆菌细胞在37碳源充足的时候，分裂一次需要46分钟；而在碳源不充足的时候，分裂一次需要10个小时，但是在两种情况下，DNA复制的速度都是40分钟左右,大肠杆菌的复制调控, 调节蛋白通过与复制复合物的相互作用确定复制起始的频率 和复制方式。,复制子由起始物位点和复制起点两部分。,大肠杆菌染色体DNA的复制调控 复制起始不依赖于细胞

44、分裂，复制终止则能引发细 胞分裂。 复制调控主要发生在起始阶段。 dnaA-ADP复合物；,DNA复制的调控机制之一,细菌(E.coli)DNA每个细胞周期复制一次可能受OriC甲基化的控制,甲基化-活化,半甲基化-失活,对dam- E.Coli 的研究表明，半甲基化的OriC不能发动一轮新的复制 在复制过程中，OriC的半甲基化状态约保留13 min。而在基因组其它区域的GATC位点，在复制后1.5 min内即被甲基化。,6646bp的小质粒 宿主细胞的拷贝数为20-30个拷贝,ColEI 质粒, ColE1 DNA复制不依赖于本身编码的蛋白质， 而是完全依靠宿主DNA聚合酶。, 质粒DNA

45、编码两个负调控因子Rop蛋白和反 义RNA（RNA1), 它们控制了起始DNA复制 必须的引物合成。,ColEI 质粒DNA的复制调控,ColE1质粒DNA的复制调控,前导链的合成,oriV,引物RNA前体的转录起始于复制起点上游555个核苷酸处，需经RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，然后由DNA聚合酶I在引物的3末端起始DNA合成。 RNA1的编码区在引物RNA编码区的5末端，转录方向与引物RNA相反，因此与引物RNA的5末端互补。 RNA1通过氢键配对与引物RNA前体相互作用，阻止了RNaseH加工引物前体，使其不能转化为有活性的引物而对复制起负调控作用。,当不存在RNA1时，

46、RNA引物前体形成自身的发夹结构，起类似终止子的作用 当前体RNA与RNA1互补配对时，类终止子效应消失，引物前体的转录被继续，阻止了RNase H加工引物前体 Rop蛋白能够提高前体RNA与RNA1的相互作用，加强负调控作用,质粒Col 1的复制调控,负调控因子Rop蛋白和反义RNA共同控制了 复制起始所必须的RNA引物的合成，从而来 控制DNA复制的起始,真核细胞的复制调控,（1）细胞生活周期水平调控 （2）染色体水平调控 （3）复制子水平调控, 真核细胞中DNA复制3个水平的调控,（1）细胞生活周期水平的调控,也称限制点调控,即决定细胞停留在G1期还是S期， 许多外部因素和细胞因子参与限

47、制点的调控。 促细胞分裂剂、致癌剂、外科手术切除 四磷酸二腺苷、聚ADP-核糖,染色体水平调控,决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子 按一定的顺序在S期起始复制,与染色体是否处于活化状态有关,（3）复制子水平调控,决定复制的起始与否，高度保守,复制子参与的多种因子均可参与调节， 主要是复制起始调控， 如酵母复制起始受时序调控。,复制起始的许可因子（licensing factor）调控,激活状态的，为下一次复制提供起始信号,复制完成后，核内的licensing factor失活,细胞质中合成新的licensing factor,核膜的裂解，licensing factor才有机会 与核物质一起进入,进入细胞核，licensing factor就会活化,原核生物与真核生物DNA复制的不同点,