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1、豆科根瘤分子细胞生物学（一） （豆科根瘤发育中的信号物质研究进展）,焦成瑾 2007. 12. 06,光合作用与生物固氮是自然给予人类的两大贡献，它 们分别提供了植物生长的碳源和氮源，从而提供了人 类社会发展的最基础的物质条件，是农业生物学最基 础的研究课题。 生物固氮是指由固氮微生物将氮气转化为氨的过程。 1995年联合国粮农组织（FAO）粗略估计，全球每年 由生物固定的氮量近 2106 t，约占全球植物需氮量 的3/4。,1 无机态氮，即铵态氮（NH4+）和硝态氮（NO3-）。 2 有机态氮，如尿素等。 这些氮素的来源？,植物所能利用的氮素,1 生物固氮（占90） 2 工业固氮（生产氮素化
2、肥） 3 高能固氮（闪电）,大气中的氮气可通过下面途径被“固定”,自 然 界 氮 素 循 环,工业固氮,高能固氮,生物固氮,有机氮合成及转化,氨化作用,硝化作用,反硝化作用,O2不足,硝化细菌,反硝化细菌,亚硝酸盐,生物体有机酸,NO3-,NH4+,NO2-,NO,N2O,大气 N2,同化作用,氨化作用,硝化作用,硝化作用,反硝化作用,生物固氮,同化作用,还原作用,氮循环,生 物 固 氮 （固氮微生物）,1 共生固氮 如根瘤菌与豆科植物； 2 联合固氮 如放线菌与非豆科植物。 3 自生固氮 如圆褐固氮菌（好氧）； 梭菌（厌氧）。,共 生 固 氮,自然界有豆科植物19700种，其中已知可以 结瘤
3、固氮的有2800种，占15，而对其共生 固氮体系进行过研究的只占0.5。,豆类植物根瘤形成的主要过程,一 豆类植物根分泌黄酮类物质 二 根瘤菌分泌结瘤因子 三 豆类植物与根瘤菌的相互识别 四 豆类植物对根瘤菌的反应 五 根瘤发育 六 根瘤成熟并开始固氮,豆类植物根瘤形成的主要过程图解,侵入线,一 豆类植物根分泌黄酮类物质,1 促进根瘤菌生长 2 对根瘤菌的趋化作用 3 对根瘤菌结瘤基因的诱导 4 在根瘤发育与固氮中的作用 5 环境因素对黄酮类物质分泌的影响,常见豆类诱导结瘤的黄酮类物质,二 根瘤菌分泌结瘤因子,1 结瘤因子的结构 2 结瘤因子的合成 3 结瘤因子的功能,1 结 瘤 因 子 的
4、结 构,根瘤菌分泌的脂酰几丁质寡聚糖（LCO)（即脂酰基-N-乙酰葡糖胺寡聚物）。,NodC（聚乙酰氨基葡糖合成酶）,NodF、E（酰基载体蛋白、 酮脂酰合成酶）,NodB（脱乙酰酶）,NodL（乙酰转移酶）,NodM（葡萄糖胺合成酶）,NodH(磺基转移酶） NodP(硫酸化酶） NodQ( APS激酶）,还原端,非还原端,2 结瘤因子的合成及结瘤基因,结瘤因子由黄酮类物质诱导根瘤菌的结瘤基因 表达而最终合成。 1）共同结瘤基因 2）结瘤调节基因 3）宿主专一性基因 4）其它结瘤基因,1）共同结瘤基因,nodA、B、C 是根瘤菌中最保守的基因，即在不同的根瘤菌中同源性很 高，功能上可以在不同
5、根瘤菌之间相互交换而不改变其宿 主范围，一种根瘤菌的基因突变可以被其它根瘤菌的相应 基因所互补。 nodABC 在基因组内是紧密连在一起的，位于同一操纵子的3个阅读框架 中，转录方向一致。 nodA 酰基转移酶，将长链脂肪酯连接到聚乙酰氨基葡糖分子非还原端。 nodB 脱乙酰酶，催化聚乙酰氨基葡糖分子非还原端脱乙酰基反应。 nodC 表达的蛋白NodC位于膜上，与聚乙酰氨基葡糖合成酶高度同源， 在N 乙酰葡萄糖胺之间形成-1,4糖苷键所必需。,2）结 瘤 调 节 基 因,nodD是结瘤正调节基因，在根瘤菌中普遍存在，它的表达是组成型的， 其蛋白在根际与特定的黄酮类物质结合后可以激活nodABC
6、及其它一系 列结瘤基因的表达。 在nodABC的上游区，有一段高度保守的序列，称为结瘤盒（nod-box）, 大约25-50bp，不同根瘤菌此序列长短不一，是一段调节序列，为结瘤基 因转录激活所必需， nodD的产物NodD蛋白的N末端就结合在一这位 置，而其C末端与特异的黄酮类化合物结合。 nodD在不同的根瘤菌中拷贝数不同，在多数根瘤菌中只有一个，但有些 为3，甚至5个。 由于NodD蛋白与特定的黄酮类物质结合后，才能激活相应的结瘤基因， 所以nodD在一定程度上决定根瘤菌的宿主专一性。,3）宿主专一性基因,不同的根瘤菌此类基因不同，基因种类也不完全一样，它们 中大部分在根瘤种内功能是保守
7、的，可以互补，种间功能不 能互补。其功能是影响根瘤的结瘤速率一数量，更主要的是 影响宿主专一性，它们的突变，会引起宿主专一性的丧失或 扩大宿主范围。如nodE、F、G、H、P、Q、M、N、L、I 等。 它们中有些与结瘤因子侧链的化学修饰有关，有些其功能目 前仍不确定。,4）其 它 结 瘤 基 因,根瘤菌在侵染宿主根毛细胞时，必须能被根毛细胞所识别， 因此有许多基因决定其细胞表面组分的合成，它们包括合成 根瘤菌胞外多糖的exo基因，脂多糖的lps基因，合成荚膜多 糖、K抗原和-1, 2-葡聚糖的ndv基因。 上述基因的突变将不同程度扰乱根瘤菌的侵染过程。,3 结瘤因子的功能,参见：豆类植物对根瘤
8、菌的反应 结瘤因子除了能引起宿主根毛细胞产生反应 外，还能对非豆类植物产生多方面的生理效 应。,三 豆类植物与根瘤菌的相互识别,1 宿主根毛细胞表面多糖与根瘤菌表面多糖之间相互识别 2 宿主根毛细胞膜上结瘤因子的受体与结瘤因子的结合,相互识别,1 植物凝集素（phytohaemoglutinins,即lectins)：很可能与这 一识别有关。由于凝集素是多价的，它可以介导宿主根毛表 面与根瘤菌细胞表面的结合。存在于根瘤菌表面的植物凝集 素受体是一种脂多糖（可能是荚膜中的一种成分），称为O 抗原。 2 结瘤因子受体：最近人们发现了NFR5、NFR1和NORK三种结瘤因子受体，它们均属激酶类受体，
9、前两者主要在结瘤早期起作用，而第三可引发结瘤因子信号的级联放大。,四 豆类植物对根瘤菌的反应,1 根毛变形 2 根毛质膜去极化 3 根毛细胞中Ca2+的振荡 4 根毛细胞中H+浓度的变化 5 根毛细胞中肌动蛋白纤丝的重组 6 根毛中根瘤菌侵染线的形成及延伸 7 根皮层细胞的重新分裂形成瘤状组织 8 根毛细胞中结瘤素基因的表达,6 根毛中根瘤菌侵染线的形成及延伸（一）,根毛末端细胞壁在根瘤菌的影响下内陷，根瘤菌随之进入，后被局限在侵染线内。侵 染线是宿主细胞分泌的纤维素物质包围根瘤菌所形成的一种管状结构，管壁与根细胞 壁类似，通常在侵入发生几小时后就出现。 侵染线的形成与延伸可视为是一种侵染与防
10、御排斥相平衡的结构。在一些不平衡的例 子中，可以看到或者是根瘤菌自由地在根毛细胞内泳动，或者是在根瘤菌开始繁殖之 前侵染线就被宿主细胞沉积的细胞壁物质所阻断。 侵染线形成后，随着根瘤菌的分裂，不断向根毛基部延伸，到达根毛细胞基部的细胞 壁时，在根瘤菌分泌的果胶酶的作用下，侵染线壁与细胞壁连接起来，穿过表皮细胞 向根内推进。当侵染线抵达皮层的36层细胞时，处在前方靠近内皮层的细胞被刺激 开始分裂，分化成根瘤分生组织。随着根瘤分生组织的不断分裂，根瘤不断长大，在 根的表面出现突起。不断增大的根瘤其细胞分化为外层同时侵染线会在皮层细胞内分 支，这样更多的皮层细胞被侵染。在侵染线生长过程中，根瘤菌不断
11、产生生长素。 侵染线内的根瘤菌多呈短杆状，成单行或数行排列。并被自己分泌的粘多糖包围，侵 染线停止生长后 ，侵染线的壁为宿主皮层细胞分泌的纤维素酶所溶解，根瘤菌则被释 放进入宿主细胞中，116个细菌共同包在外膜中，这时根瘤菌脱去外壁分化为类菌 体，才开始固氮。而宿主细胞丧失分生能力，由邻近皮 层细胞分裂形成分生组织。,6 根毛中根瘤菌侵染线的形成及延伸（二）,对于无限根瘤来说，侵染线中释放出根瘤菌后，这些细胞中的根瘤菌分 化成类菌体形态并开始固氮。邻近的分生组织不断分裂，瘤组织变大， 逐渐穿过皮层向外长出；侵染线随之也折转方向由内向外延伸，侵染新 生成的瘤组织细胞。这一过程一直进行到根瘤从根上
12、长出相当长时间后 才停止。时间长短随种类不同而异。 有限型根瘤，根瘤的分生组织通常是短命的，瘤内被感染细胞的老幼差 别不显著，根瘤寿命一般短于无限型根瘤。,五 根瘤发育,根瘤的发育起始于主根靠根毛附近的皮层细胞分裂，而这一过程的触发最 终源于宿主细胞对结瘤因子等信号物质的感知，然而根瘤本身是一个完整 的器官，如无限型根瘤（豌豆根瘤）主要结构有： 根瘤表皮和皮层； 分生组织（有限型无分生组织，如大豆根瘤） ； 感染区（包括早期共生区、成熟区和衰败区）； 维管束； 细胞间隙； 因此，根瘤的发育除了受结瘤因子的作用外，必然涉及多种植物激素的共 同调节。,植 物 激 素 对 根 瘤 发 育 的 影 响
13、,1 生长素：对根瘤的发育有双重调节作用。根瘤发育起始， 根中生长素的含量很低，有利于根瘤原基的形成，而之后其 含量会升高这样可以抑制其它根瘤原基的形成。 2 细胞分裂素：已经检测到豌豆幼龄根瘤和发育中的根瘤含 有较高的细胞分裂素，而成熟的根瘤中其含量很低。人们推 测这种含量的差异可能是结瘤因子影响的结果。 3 乙烯和脱落酸均可抑制根瘤的形成，从而可以控制根瘤的 数量。 4 赤霉素可以促进结瘤。,六 根瘤成熟并开始固氮,成熟根瘤中会合成大量的豆血红蛋白，以便为类菌 体提供氧气，并维持低氧水平，以保证对氧敏感的 固氮酶的活性。豆血红蛋白中，球蛋白部分是宿主 合成的，而血红素部分由类菌体。,结瘤因子的多方面功能,黄酮类生物合成主要分支,缩合鞣质,花色素苷,异黄酮类,鞣 红,结瘤早期宿主与根瘤菌之间的信号交流,根瘤菌侵染过程中根的形态学反应,几 种 豆 类 植 物 根 瘤,