聚合酶链式反应-2011分子生物学.ppt

《聚合酶链式反应-2011分子生物学.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《聚合酶链式反应-2011分子生物学.ppt（108页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、第三章 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR）,王晓华,聚合酶链反应,又称体外DNA扩增技术。是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸循环操作，在体外特异地扩增所需要的DNA片段的一种技术。它能快速将皮克(pg)水平的DNA特异地扩增100万倍左右，达到微克(g)水平。 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等。,在分子生物学、基因工程研究，以及遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。 并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，便于对目的基因进行分析、鉴定。,目的基因,载体,复制子,宿主细胞

2、,扩增,扩增,提取DNA分子,通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程，操作复杂,一般需要数周时间。,70年代的初期由Dr. H. Klenow发现了较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli ； 1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的Taq polymerase ，它的特性能耐高温。 80年代之后它被广泛运用； 1983年美国Mullis等人发明了聚合酶链反应方法； 1985年美国PE-Cetu

3、s公司开发出了具有应用价值的PCR技术； 1987年引入了耐高温的DNA聚合酶，从而使PCR成为一项成熟的技术，而迅速在世界各地推广。 1993年Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。,PCR技术的发现,Kary B Mullis,(1944-),1983 年提出PCR方法 1993年度诺贝尔化学奖,一、PCR基本原理,PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生物体内的DNA复制过程。 依据DNA半保留复制的机理。 PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。,第一节 PCR技术的原理和特点,细胞内复制的过程,1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解链成两条单链，各自作为模板。 2）引物酶以两条单链

4、为模板各自合成一段引物，引物提供3-OH末端。 3）DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板，以dNTP为原料，按照碱基配对的原则，从引物的3端，循53方向，将脱氧核苷酸聚合，最终形成子代的DNA双链。,Denaturing 95C,Annealing Tm-5C,Extension 72C,PCR的原理,PCR的基本过程,1.变性：将反应体系升温至95左右，样品中双链DNA解开成两条单链，各自作为模板（待拷贝的 DNA 称为模板） 。 2.退火：将温度降至引物的Tm值以下(55左右)，5端和3端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合。,3. 延伸：将温度升到75左右，耐热的Taq DNA聚合

5、酶催化四种 dNTP，从引物3-OH端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补的DNA链。,5,5,3,3,5,DNA聚合酶,5,PCR产物的鉴定、提取,PCR的扩增效应,理论上，每增加1个循环，双链DNA片段会增加1倍，使DNA量可成指数(2n)增加。 实际上，扩增效应低于指数增加，约为(1+X)n。 一般进行30个左右的循环，特定区域的DNA量可至少增加 106 倍。,PCR产物的积累规律,PCR反应初期，目的DNA片段的增加呈指数扩增。随着目的DNA扩增产物的逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，此时DNA扩增产物的增幅减慢，即出现“平台效应”。 到达平台期所需要的循环次数一般在3

6、0次循环之后。,PCR DNA复制 部位： DNA体外合成放大过程 生物体内DNA合成 引物： DNA引物 RNA引物 （作为新链的一部分） （复制终止时被切除） 催化酶：TaqDNA聚合酶 DNA聚合酶 有5 3核酸外切酶 有5 3核酸外切酶 无3 5核酸外切酶 有3 5核酸外切酶 基本过程：每循环一次包括 复制起始、链延伸和 变性、退火、延伸 终止三阶段 反应实质：扩增靶DNA 合成子代DNA,PCR仪,聚合酶链反应中的变性、退火、延伸的温度和时间，以及循环次数，是由具有程控的快速升温和快速降温装置的PCR仪控制。,PCR仪,越快，越精确，越昂贵,ABI 7500实时荧光定量PCR仪,普通

7、梯度PCR仪,二、PCR技术的特点,1. 高度的敏感性：可将极微量(pg)DNA，扩增到紫外光可见的水平(ug)，这是最主要的特点，它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。,2. 高度的特异性：PCR扩增的特异性由两个引物的序列决定，因此引物设计至关重要。 引物与模板DNA特异正确的结合； 遵循碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决 定PCR反应结果的关键。 引物设计的原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,基因组,3. 适用样品的广泛性： 对样品的要

8、求并不十分严格： 1)可以是DNA，也可以是RNA 2)可以是纯化的，也可以是粗制的 3)可以是新鲜组织，也可以是陈旧组织 4)可以是细胞，也可以是体液 4. 操作简便、快速：PCR自动化，数小时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。,三、参与PCR反应体系 的因素及其作用,模板 引物 Taq DNA聚合酶 dNTP Mg2+,缓冲液 反应温度 循环次数 PCR仪等,PCR体系,（一）模板核酸,1. 模板：指能扩增靶DNA片段的核酸 2. DNA是直接模板，RNA是间接模板,RNA样品必须先经过逆转录生成cDNA， cDNA作为PCR扩增的模板。这个技术称为逆转

9、录PCR（RT-PCR）。,病原体标本：有病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等。 病理生理标本：有细胞、血液、绒毛、羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养细胞系。 法医学标本：有血斑、精斑、毛发等。 考古标本：残留有核酸物质,3. 常见的扩增对象(含核酸的标本)：,4.避免有影响扩增反应的物质存在 如：核酸酶：降解DNA、RAN 蛋白酶：降解Taq DNA聚合酶 血红素、抗凝剂：抑制Taq DNA聚合 酶活性 理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板。,5. 模板量要合适，一般为102105拷贝。,50l PCR反应体系中模板DNA推荐使用量

10、,（二）引 物,1）引物：2条人工合成的、能与模板DNA互补结合的脱氧寡核苷酸。,1. 引物的性质和作用,2）引物的序列：根据欲扩增的DNA片段两端序列而设计的。,5端引物：与模板链的5端序列相同； 3端引物：与模板链的3端序列互补。,3) 引物决定PCR扩增产物的特异性和 长度。,4) 引物设计决定PCR反应的成败。,特异性：引物只针对DNA的一个特定序列互补结合，因此2条引物与DNA模板特异性结合决定了要扩增的DNA区域。 长度：2条引物分别互补于所要扩增DNA片段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的部位。,2. 引物设计的基本要求,1）引物长度要合适，一般为1630个核苷酸，常用2

11、0bp左右。,引物过短：会影响PCR的特异性； 引物过长：需提高相应的退火温度，若超过延伸温度即Taq DNA酶的最适温度，则影响PCR反应产物。,2）G+C含量一般占5060，有利于引物与模板的结合。G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。 3） ATCG 4 种碱基随机分布，避免连续出现3个以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，最好随机分布。否则易使引物与模板的嘌呤或嘧啶密集区发生错配。 4）引物内部不能存在互补序列，以避免形成发夹结构。 5）两个引物之间不能存在互补序列，以避免形成引物二聚体。,6）引物与非特异性序列的同源性不能超过70%或不能有连续8个碱基互补，否则导致非特

12、异性扩增。 7）引物3末端碱基一定要与模板正确配对，引物3端最佳碱基选择是G和C。 8）引物的5端可以修饰，如：引入酶切位点、启动子序列、用荧光素、生物素等标记等 9）引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。,5,限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记,引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,3.引物的使用要求,引物浓度要远高于模板浓度，一般每条引物的浓度0.1 0.5 mol，以最低引物量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 合适的退火温度比引物本身的Tm低 5 ，一般在 55 左右

13、。,（三）Taq DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶是从一种水生栖嗜热菌YT1株(一种嗜热真菌)分离提取出来，该酶基因全长2.49kb，编码832个氨基酸。该酶虽然在90以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性。（天然酶） 另一类通过基因工程合成的酶。（基因工程酶） Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。,(一)酶活性与热稳定性,1）酶蛋白分子量 94KDa，比活性200 000/mg，Taq酶的浓度通常为12.5/l，太多浪费并易导致非特异性扩增。 2）热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温 在92.5、95 、97.5时，

14、PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。 PCR反应时变性温度为9520sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。,1）Taq DNA聚合酶是Mg2+ 依赖性酶，对Mg2+ 浓度非常敏感。 2）Mg2+浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。 3）Mg2+ 能与dNTP结合而降低PCR反应液中游离的Mg2+ 浓度，优化浓度一般反应 中Mg2+ 浓度至少应比dNTP总浓度高0.51.0 mmol/L。 4）适当浓度的KCl能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高5060%。,(二)离子依赖

15、性,1）TaqDNA聚合酶具有53 聚合酶活性和53外切酶活性，而无3 5外切活 性，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4。 2）Taq DNA聚合酶还具有逆转录酶活性.,(三)忠实性,(四) Taq酶的最适温度,7580每个酶分子可延伸约150个核苷酸/秒，70延伸率大于60个核苷酸/秒，55时为22个核苷酸/秒。最适温度75左右。,（四）原料,原料：四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)：浓度为 20200mol/L。 Mg2+：为Taq 酶的必需激活剂。 浓度为0.52.5mmol/L。 太少：酶活性明显降低； 太多：导致非特

16、异性扩增。,（五） Mg2+,反应温度和时间,1. 变性： 95，30”1 双链DNA变成单链。 2. 退火：55，30”1 引物与模板互补结合。退火温度对特异性影响很大。退火温度=Tm值-(510) Tm值(解链温度)= 4(G+C)2(A+T） 3. 延伸：7275， 1 2 Taq 酶催化dNTP，从引物3-OH端开始，与模板互补，合成一条新的DNA链。,小于20bp 片段,反应缓冲液：常用10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.38.8为Taq 酶最适pH值。 循环次数：主要取决于模板DNA的起始浓度，合适的循环数为25 30次。 循环数太少：产物量不多 循环数太多：非特异性

17、扩增会增加，出现平台效应,PCR反应体系,5扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双蒸水至 50ul,四、PCR常见问题,1.无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太低延伸时间太短,原因,对 策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 提高退火温度、延长延伸时间,现象：对照组有条带

18、，而样品则无；,2. 非特异性扩增,现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 循环次数过多,原因,对 策,重新设计引物 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低Mg2+浓度 减少循环次数,非特异性扩增,3.拖尾,现象：产物在凝胶上呈拖尾状态。,M 1 2,模板不纯 降解 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多,原因,对 策,纯化模板 改变条件 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和Mg2+的浓度 减少循环次数,拖尾,4.假阳性,原因：靶序

19、列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,五、 PCR实验注意事项,由于PCR的灵敏性极高，故微量的样品污染便可导致假阳性结果的出现。所有的溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染 采取的措施： 1）隔离不同的操作区 2）采用一次性用具 3）严格按无菌操作原则进行 4）并设置严格的对照，以提高PCR结果的正确性。,除实验样品外，应设几种实验对照： 1）阳性对照：阳性DNA模板参与的PCR反

20、应；阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本。 2）阴性对照：无核酸模板参与的PCR反应；在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以检测试剂是否污染。,示例电泳结果,1 2 3 4 5 M,M：DNA marker 1：为阳性对照 2：为阴性对照 3-5：为扩增出的DNA条带,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,六、 PCR技术的主要用途,PCR,利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段。,1. 目的基因的克隆,基因工程产品,A,内源

21、性病变基因,正常人,A,病 人,病原微生物基因,正常人 (-),病 人 (+),2. 基因检测,遗传病的诊断,基因缺失、插入或置换等,地中海贫血,珠蛋白链合成障碍，或珠蛋 白的组分改变，功能降低,A,正常人,病 人,正常,病人,ASO探针法,病人,PCR-ASO检测基因点突变：主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段，然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交,探针杂交,NC膜,探针,正常人,突变纯合子,突变杂合子,PCR-RFLP（restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态体）法：,限制性核酸内切酶,恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）,

22、Ras基因,突变,限制性核酸内切酶,正常,突变,电泳,3. DNA和RNA的微量分析,PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。,PCR后将待测DNA片段既可克隆到特定的载体进行序列测定，也可直接测定。 PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；,使用引物对靶序列进行扩增，就可掺入同位素或非同位素标记的各种碱基，获得所需比活性的探针 。,4. DNA序列测定,5. 用PCR标记DNA探针,mRNA,第二节 常用几种PCR反应,1)RNase 2)碱性液,(水解RNA),单链DNA,逆转录酶 (使dNTP 聚合),RNA-DNA

23、杂化链,PCR,一、逆转录 PCR,DNA 聚合酶,双链DNA,(使dNTP 聚合),PCR,二、实时 PCR,实时PCR（real-time polymerase chain reaction）又称荧光定量PCR。是指在PCR反应体系中加入荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。 实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，

24、消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR，得到广泛应用。 荧光定量PCR标记方法： 序列特异性探针：如 Taqman 内掺式染料：如SYBR Green I,PCR引物,实时PCR技术原理,引物之间一段带有标记寡核苷酸链，称作探针,报告基团,淬灭基团,无荧光信号产生,能量,完整的探针：5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移）,变性 (95C),退火 (60C),退火 (60C),?,53外切酶活性 将探针5端连接的荧光基团从探针上切割下来,实时PCR技术原理,荧光报告分子,荧光淬灭分子,荧光信号,SYBR Green I作用机理,SYBR Gr

25、een I作用机理,原位PCR(In Situ PCR,IS-PCR)是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内进行原位扩增目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物进行定性定量定位分析。 即把原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏度相结合的技术。,三、原位 PCR, 待检标本先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，dNTP等均可进入细胞内或细胞核内。 以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜

26、内外弥散，被保留在原位。使原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。 使用专用原位PCR的仪器。,用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；,已知序列,未知序列,未知序列,四、反向 PCR,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,未知序列,已知序列,不对称PCR 用不等量的一对引物扩增后产生大量的单链DNA（ss-DNA） 。 这对引物分别称为非限

27、制引物与限制性引物，其比例一般为501001。在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。 产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。 主要为测序制备ss-DNA，为了制备探针。,五、不对称 PCR,高浓度引物,低浓度引物,巢式PCR（nested PCR），利用两套PCR引物对（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。 第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。,六、巢式PCR,巢式PCR的使用降低

28、了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了特异性。,彩色PCR（Color complement assay）是用荧光染料标记引物的5端。 荧光染料JOE和FAM呈绿色荧光；TAMRA呈红色荧光；COUM呈蓝色荧光。 不同荧光标记的引物同时参加反应，扩增后的目的基因会分别带有引物5端的染料，通过电泳就可以根据不同荧光的色泽直观判断目标基因是否存在及扩增基因的类型。 可用于基因诊断，如诊断基因缺失、染色体易位或感染某种病毒。可用更多的色彩，同时检测多种基因成分。特别适合大量临床标本的基因诊断,七、彩色 PCR,标记引物,观察,PCR产物,