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1、胰腺干细胞与胰岛混合养 对其转化率的影响,研究背景： 糖尿病（diabets mellitus,）是危害人类健康的重要疾病之一，胰岛移植已成为治愈型和部分型糖尿病的有效途径。但胰岛移植使胰岛供体短缺的矛盾日渐突出，制约了其在糖尿病治疗领域的临床应用。因此，寻找可替代的其它来源的胰岛细胞成为近年研究的热点，而干细胞诱导分化为胰岛细胞是最重要的研究方向之一如何诱导胰腺导管干细胞分化为可自身合成胰岛素的前体细胞，目前尚无稳定的诱导方案目前，成体胰腺导管干细胞特性已得到证实，并已经通过诱导获得胰岛样结构,假说：胰腺导管干细胞与胰岛混合培养可提高胰腺导管干细胞向前体细胞的转化率，其作用与细胞角蛋白-19
2、（CK-19）的表达密切相关。,目标：研究胰腺导管干细胞与胰岛混合培养对增加胎鼠胰腺干细胞向前体细胞转化率的作用及机制,研究内容：分为胰腺导管干细胞单独培养组（组），胰岛单独培养组（组）及干细胞胰岛混合培养组（组）。型胶原酶消化大鼠胰腺获得胰岛后，使用FICOLL-400梯度离心法纯化胰岛；采用胶原酶消化法获得胎鼠胰腺导管干细胞进行培养，通过RT-PCR及免疫组织化学染色的方法，检测CK-19、巢蛋白、胰高血糖素和胰岛素等干细胞相关标志物。干细胞诱导培养基中加入纯化的胰岛进行混合培养，通过观察干细胞表达胰岛素的阳性率评价其诱导转化率。,实验材料与主要试剂 25mL 细胞培养瓶、24孔板,fic
3、oll-400;-巯基乙醇、型胶原酶、HEPES、丫啶橙碘化丙锭（AO/PI）、0.25%胰酶-EDTA（sigma）；RPMI1640培养基、低糖和高糖DMEM 培养基、胎牛血清（ FBS ）、牛血清白蛋白（BSA）、Trizol、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、尼克酰胺（）；兔抗大鼠巢蛋白抗体、山羊抗大鼠CK-19抗体、小鼠抗大鼠胰岛素抗体、小鼠抗大鼠胰高血糖素抗体;山羊抗小鼠、山羊抗兔、兔抗山羊FITC荧光抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；双硫腙（DZT）为上海试剂三厂产品；RT-PCR试剂盒，大鼠胰岛素ELISA试剂盒（）。,实验动物 40只wistar
4、大鼠，周龄，体质量250300，雌雄不限；20只孕14的wistar大鼠，体质量500550。,方法： 1.实验分组 本实验共分为胰腺导管干细胞单独培养组（组），胰岛单独培养组（组）及干细胞胰岛混合培养组（组）。各培养组细胞来源样本数均为个，各样本的细胞均来自不同的实验动物个体。,2. 成年大鼠胰岛的分离、纯化与培养 取成年wistar大鼠，麻醉后取上腹部肋缘下横切口，丝线结扎胆总管入十二指肠处，胆总管内插管，逆行向胆总管内灌注0.8g/L的胶原酶-10mL，分离胰腺置于胶原酶-溶液中（ 0.8g/L ），38水浴静止消化17min取出后震荡15s，60目筛网筛过后加入含10%FBS的Hank
5、s液终止消化，1000r/min离心2min，洗涤遍。沉淀加入4mL25%的Ficoll溶液重悬，依次加入23%、20%、11%的Ficoll溶液，、3000rpm离心20min。收集23% 20%界面和20% 11%界面的细胞悬液，并加入含10%FBS的 Hanks液，、 1000rpm离心，洗涤遍。手工挑拣直径大于100的胰岛，悬浮于有RPMI1640培养液（含105u/L 青霉素、100g/L 链霉素、20mmol/LHEPES,15%FBS）的24孔板中，每孔胰岛50个，37、5%CO2培养箱培养，隔日半量换液。,3. 胰岛细胞产量、纯度和存活率计算以及生物学活性鉴定 DTZ染色法计算
6、产量及纯度；AO/PI荧光染色计算存活率； 在培养的第113天，测定培养液中的胰岛素水平； 在胰岛培养的第3、5和10天，分别测定低糖及高糖刺激下的培养物胰岛素释放水平，同时计算胰岛刺激指数。,4. 胰腺导管干细胞的体外分离、培养、鉴定与诱导分化 取孕14d的wistar大鼠腹中胎鼠的胰芽，胶原酶消化法取得原代细胞，置于含10% FBS的高糖DEME培养基中，待细胞生长铺满平底后以1:3传代，取第代细胞行CK-19、巢蛋白、胰高血糖素和胰岛素免疫组织化学及RT-PCR检测。 相关检测证实细胞胰腺导管干细胞相关标志物阳性后，改用含10% FBS 、 b-FGF(20ug/L）、EGF(20ug/
7、L）以及1%尼克酰胺的高糖DMEM 培养基进行诱导。,5. 胰岛与胰岛干细胞的混合培养 干细胞胰岛混合培养组的干细胞在更换诱导培养基的同时向培养板中加入50个孔手工分拣的胰岛（直径100um）。,6 胰腺导管干细胞的鉴定及其诱导分化率的比较 （1）-检测胰腺导管干细胞标志物基因的表达 Trizol提取诱导分化前的第代胰腺导管干细胞总，按照逆转录试剂盒的说明将逆转录成cDNA。将反转录产物稀释到10uL并取10uL进行PCR扩增，反应体系为50uL。反应条件：94 预变性3min，93 30s，5630，72 1min，循环30次，72再延长7min1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果。各引物序列、预
8、计产物长度和退火温度见下表。诱导分化后，再次检测胰腺导管干细胞标志物基因的表达。,(2)免疫荧光细胞化学染色 取诱导分化前的第2代胰腺导管上皮干细胞以1105个孔铺96孔板，待细胞融合达80%,吸去培养液，PBS冲洗次；以多聚甲醛溶液固定1015min，用PBS冲洗次；加0.3 Triton-100，室温放置15min，PBS冲洗次；加 BSA，放湿盒内封闭30min；吸去BSA，各孔滴加稀释的一抗（稀释），放冰箱过夜后冲洗次；加荧光标记二抗，放湿盒中，避光孵育30min，PBS冲洗次。空白对照组以PBS替代一抗，其余条件与上述相同。各抗体浓度见下表。诱导分化后，再次检测以上指标。,7.统计学
9、处理 采用SPSS13.10统计软件进行两个样本的检验分析及重复测量设计的方差分析，以a=0.05作为检验水准。,胰岛及干细胞培养的形态学观察结,:胰岛干细胞共培养第天；：胰岛干细胞共培养第天；：胰腺干细胞诱导前；：胰腺干细胞诱导培养第天；：胰腺干细胞诱导培养第天；：胰腺干细胞诱导培养第天,胰岛分离纯化结果及产量、纯度和存活率,DTZ染色显示，胰岛细胞形态完好呈猩红色。每只胰腺可获得胰岛细胞（34538）个。Ficoll纯化后获得（25442）个胰岛细胞，平均纯度为（8713）%，平均回收率为74.3%。AO/PI染色后显示，胰岛制备物存活率大于95%,基础胰岛素测定,胰岛单独培养组第天胰岛素
10、分泌达峰值，随后下降，第天，胰岛素分泌量约降为最高值的。干细胞胰岛混合培养组胰岛素水平在第天达到峰值，但下降速度较慢，第天仍维持在峰值水平的左右。两组第9,11,13天差异有统计学意义（0.05）。干细胞单独培养组培养液中未检出胰岛素分泌。,基础胰岛素水平,胰岛素释放试验结果,除第天胰岛单独培养组的高糖及低糖刺激下胰岛素分泌量无统计学差异外（0.05），其余各组内同日低糖与高糖刺激下胰岛素分泌量的差异均有统计学意义（均0.05）。干细胞单独培养组培养液中未测出胰岛素。,免疫组织化学检测结果,：CK-；：巢蛋白：胰高血糖素；：胰岛素,诱导分化前，胰腺导管干细胞同时表达-、巢蛋白及胰高血糖素，但不表达胰岛素。诱导分化后，干细胞单独培养组和干细胞胰岛混合培养组中除上述指标继续表达外，胰岛素也开始表达,RT-PCR第代胰腺导管细胞表达-、巢蛋白和胰高糖素，不表达胰岛素。诱导分化后胰岛素开始表达。,：CK-19 ：巢蛋白：胰高血糖素：胰岛素,胰腺导管干细胞诱导分化率的比较 免疫组化结果显示，诱导后干细胞单独培养组和干细胞胰岛混合培养组之间干细胞表达巢蛋白和胰高血糖素之间的差异无统计学意义（）。混合培养组表达-及胰岛素的细胞阳性率高于干细胞单独培养组（）,干细胞各指标表达率,本实验结果证实：胰腺导管干细胞与胰岛混合培养可提高胰腺导管干细胞向前体细胞的转化率,实验预算：5900元,谢谢,