色谱概论1-3章.ppt

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1、,色谱分析 概论,第一章 绪论,第二章 色谱法的原理,第三章 色谱仪,第一章 绪论,色谱法与其他方法的比较和配合,色谱法的定义与分类,色谱法与色谱法与其他方法的比较和配合 其他方法的比较和配合,第一节 色谱法的发展史,一、色谱法的出现,1906 年，俄国植物学家茨维特在研究植物叶子的组成时，用碳酸钙作吸附剂装于玻璃柱中，石油醚萃取液倒到管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素形成3 种颜色的5个色带。当时茨维特把这种色带叫做“色谱”，把玻璃管称为色谱柱，碳酸钙称为固定相 ，冲洗剂石油醚称为流动相。把茨维特开创的方法称为液-固色谱法，不仅用于有色

2、物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。色谱的“色”字虽已失去原有意义，但色谱名词仍沿用至今。,二、色谱法的发展,1931 年德国的化学家库恩重复了茨维特的某些实验，用氧化铝和碳酸钙分离了-、 -和， - 胡萝卜素，此后用这种方法分离了60 多种此类色素。 英国科学家Martin 和Syng 在1940 年提出液-液色谱法，即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某种有机溶剂。1941 年，Martin 和Synge 提出用气体代替液体作流动相的可能性，11 年之后，James 和Martin 提出了从理论到实践较完整的气-液色谱方法，从而获得了1952 年的诺贝尔化学奖。 在此基础上，1957

3、年，Golay开创了开管柱气相色谱法，习惯上称为毛细管柱气相色谱法。 1956 年，Van Deemter在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论，1965 年，Giddings 总结和发展了前人的理论，为色谱的发展奠定了理论基础。,另一方面早在1944 年，Consden 等发展了纸色谱，1949 年，Macllean 等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板，使薄层色谱法（TLC ）得以实际应用，而在1956 年，Stahl 发明出涂布器之后，才使TLC 得到广泛应用。 在20 世纪60 年代末把高压泵和化学键合相用于液相色谱，出现了高效液相色谱法（HPLC ）。 20 世纪80 年代初

4、超临界流体色谱（SFC ) 兴起。而在20 世纪90 年代毛细管区带电泳（ CZE ）得到广泛应用。同时集HPLC 和CZE 优点的毛细管电色谱在20 世纪90 年代后期受到关注。 三、色谱法的现状和未来 色谱法是分析化学领域中发展最快、应用最广的分析方法之一。这是因为现代色谱法具有分离与分析两种功能，能排除组分间的相互干扰，逐个将组分进行定性、定量分析，而且还可制备纯组分。,高效液相色谱近年来以6 -8 的速度增长，其中较活跃的领域是离子色谱、疏水作用色谱、手性分离及反相色谱。HPLC 除具有GC 的优点外，还具有应用面广，可进行制备分离的特点，多维色谱，可用于药物、蛋白质、多肽结构测定，并

5、使整个操作完全自动化，这是21 世纪色谱分析的发展方向之一。,第二节 色谱法与其他方法的比较和配合,一、色谱法的特点和优点 （一）色谱法的特点 色谱法是以其高超的分离能力为特点，它的分离效能远远高于其他分离技术如蒸馏、萃取、离心等方法。 （二）色谱法的优点 1 分离效能高。30-50m的毛细管气相色谱柱可以到每米3000多理论板数的柱效。 2 应用范围广。几乎用于所有化合物的分离和测定。 3 分析速度快，一般在几分钟到几十分钟就可完成一次复杂样品的分离和分析。 4 样品用量少。 5 灵敏度高，如气相色谱可以分析几纳克的样品。 6 分离和测定一次完成。可以和多种波谱分析仪器联用。 7 易于自动化

6、，可在工业流程中使用。 二、色谱法的缺点 1 . 对所分析对象的鉴别力是较差的。 2 . 一般来说色谱的定性分析是靠保留值定性，但在一定的色谱条件下，一个保留值可能对应多个化合物。,第三节 色谱法的定义与分类,一、色谱法的定义 色谱法或色谱分析也称之为层析法，是一种物理化学的分析方法，它利用混合物中各组分在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。分离的仪器即色谱仪。 二、色谱法的分类 色谱法可按两相的状态及应用领域的不同分为两大类。 （一）按流动相与固定相的状态分类 1 气相色谱 气相色谱又可分为气固色谱和气液色谱，前者是以气体为流动

7、相，以固体为固定相的色谱，后者是以气体为流动相，以液体为固定相的色谱。 2 液相色谱 液相色谱又可分为液固色谱和液液色谱，前者是以液体为流动相，以固体为固定相的色谱；后者是以一种液体为流动相，以另一种液体为固定向的色谱。,（二）按操作形式,按操作形式可分为柱色谱法、平面色谱法及逆流分配等类别。 1 . 柱色谱法 柱色谱法将固定相装在色谱柱里，色谱过程在色谱柱内进行。 按色谱柱粗细，可分为一般柱色谱法、毛细管柱色谱法及微填充柱色谱法等类别。 气相色谱法与高效液相色谱法及超临界流体色谱法等属于柱色谱法范围。 2. 平面色谱法 平面色谱法是色谱过程在固定相构成的平面层内进行的色谱法，又分为纸色谱法、

8、薄层色谱法及薄膜色谱法等。 用滤纸作固定液载体的色谱法称为纸色谱法。 将固定相铺在玻璃板或铝箔板上，构成一定厚度的薄层板，用这种薄层板进行分离分析的方法称为薄层色谱法。薄膜色谱法与薄层色谱法类似，主要区别是它的固定相是用高分子材料制成的薄膜。,（三）按色谱过程的分离机制分类 按色谱过程的分离机制可将色谱法分为：吸附色谱法、分配色谱法、体积排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法及毛细管电色谱法等类别。 吸附色谱法：其分离主要是基于组分在固态吸附剂表面吸附能力的差异。固定相吸附作用强的组分的色谱保留时间会较长，反之会有较短的保留时间。 分配色谱法：固定相为液态，利用样品组分在固定相与流动相中的溶解

9、度不同，引起分配系数的差别而分离。流动相的极性大于固定相的极性的液相色谱法，称为反相色谱法，常用于极性组分的分离；反之，称为正相色谱法，常用于非极性组分的分离。 体积排阻色谱法：其分离主要是基于组分分子的大小和形状。分子较大的组分不能进入固定相孔隙结构内部，很快随流动相流出，保留时间较短；而分子较小的组分可以进入孔隙结构内，保留时间较长。因此，通过体积排阻色谱可将不同大小和形状的分子分开。多用于高聚物分子质量分布和含量的测定。,离子交换色谱法：用离子交换树脂为固定相的色谱法称为离子交换色谱法，主要用于无机和有机离子型组分的分离。这种方法是靠样品离子与固定相的可交换基团交换能力（交换系数）的差别

10、而分离。 亲和色谱法：将具有生物活性（如酶、辅酶、抗体等）的配位基键合到非溶性载体或基质表面上形成固定相。利用蛋白质或生物大分子与亲和色谱固定相表面上配位基的亲和力进行分离的色谱法，称为亲和色谱法。这种方法专用于分离与纯化蛋白质等生化样品。 毛细管电色谱法：其分离机制是靠色谱与电场两种作用力，依据样品组分的分配系数及电泳速度差别而分离。毛细管电色谱法是最新的色谱法，它快速、经济、应用广，是最有前途的分析方法。,第二章 色谱法的原理,第一节 色谱分析的基本原理,在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。 色谱分析的基本原理是利用待分离的

11、各种物质(混合物质)在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。 使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。 由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。,第二节 色谱法中常用的术语及参数,一、色谱术语 1）基线：是色谱柱中仅有载气通过时

12、，检测器响应信号的记录值。基线在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况，如以下原因可能导致基线不稳：进样器被污染、检测器及柱箱温度变化、色谱柱该老化、色谱柱被污染、分流比过低、色谱柱未安装好、载气不纯、需要更换进样垫或清洗衬管等。 2）峰高（h）：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示。峰高是色谱分析中常用的定量参数之一。 峰面积（A）：是色谱峰曲线下与峰顶之间的面积。峰面积是色谱分析中常用的定量分析参数。 3）保留值,a.死时间(tM) ：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。 由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与

13、流动相的流速相近。如用热导池检测器时，从注射空气样品到空气峰顶出现时的时间。 b.保留时间（tR）：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间tM和组份在固定相中滞留的时间。 c.调整保留时间（tR）：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。 由于保留时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。 d.死体积（VM）：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间的空隙和检测器的间隙的总和。,e. 保留体积（VR)：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。 f. 调整保留体积（

14、VR）：某组份的保留体积扣除死体积后的体积 g. 相对保留值(r2,1) ：组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。r2,1只与固定相和柱温有关，不受其他色谱条件的影响。 4）区域宽度：色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，它的大小反映色谱柱或所选色谱条件的好坏。宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。 区域宽度通常有三种表示方法： 标准偏差：峰高0.607倍处峰宽处的一半。 半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354 峰底宽Wb：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。Wb= 4,气相色谱图,二、色谱流出曲线的意义： 从色谱图上可获得的信息有： 色谱峰的个数，可判断

15、样品中所含组份的最少个数； 色谱峰的保留值，可进行定性分析； 色谱峰的峰高或峰面积，可进行定量分析； 色谱的保留值或区域宽度，是评价色谱柱分离性能的依据； 色谱峰间距是固定相或流动相选择是否合适的依据。,第三章 色谱仪,第一节 气相色谱仪,一、气相色谱仪的主要部件 1. 气相色谱仪的流程,气相色谱流程,15MPa,0.2-0.5MPa,分子筛,柱前压,2. 气相色谱仪主要部件,气相色谱仪由五大系统组成：,温控系统,进样系统,分离系统,检测系统,数据处理系统及记录,流动相,固定相,气路系统,作用： a、获得纯净、流速稳定的载气 b、让载气连续运行、管路密闭的气路系统 c、对组分没有相互作用力，只

16、起到携带组分移动 的作用 组成：压力计、流量计及气体净化装置 选择原则：应考虑载气的种类和流速对柱效、分离度的影响、检测器对载气的要求（TCD用氢气；FID用氮气） 要求： a、气密性、流速稳定、流量准 b、载气要求化学惰性，不与有关物质反应 载气种类：氦气、氢气、氮气,1）气路系统,2）进样系统,进样装置和气化室 进样系统作用： a、定量引入样品 B、将样品加热气化，转入柱内 进样器：微量注射器,色谱柱的作用：分离混合组分 分离柱种类：填充柱和毛细管柱 构成：担体/载体+固定液,3）分离系统,a、填充柱： 材料：不锈钢或玻璃，内装固定相 内径：2 4mm 长: 1 10m 形状：U型和螺旋型

17、 b、毛细管柱/空心柱： 材料：玻璃或石英 内径: 0.1-0.8mm 长: 10-100m 类型：固定液涂在管内壁（气-液）、内壁涂多孔层材料（气-固） 特点：分离效率高，分析速度快、样品用量小，但柱容量低，要求检测器的灵敏度高,色谱柱类型：,检测组分的存在，并将组分的量定量地转换为电信号，加以放大。 a. 热导检测器( TCD)：是基于各种物质有不同导热系数设计的。 氢火焰离子化检测器(FID)：以氢气和空气燃烧的火焰作 为能源，利用含碳有机物在火焰中燃烧产生离子，在外加电场作用下，使离子形成离子流，根据离子流产生的电信号强度，检测被色谱柱分离出的组分。FID是气相色谱中最常用的一种检测器

18、。它的灵敏度高，线性范围宽，易于掌握，应用范围广，特别适合于毛细管气相色谱使用。 c. 电子捕获检测器(ECD)：是一种用63Ni或3H做放射源的离子化检测器，它是气相色谱检测器中灵敏度最高的一种选择性检测器。线性范围窄，只有1000左右，且响应易受操作条件的影响，重现性较差且对大多数烃类没有响应。,4）检测器,d. 火焰光度检测器(FPD)：是基于样品在富氢火焰中燃 烧，使含硫、磷化合物经燃烧后又被氢还原而得到特 征光谱的检测器。 氮磷检测器（NPD）又称热离子检测器（TID)：是在 FID的喷嘴和收集极之间放置一个含有硅酸铷的玻璃珠。适于测定氮、磷化合物的选择性检测器。 f. 光离子化检测

19、器(PID)：是利用紫外光能激发解离电位较低的化合物，使之电离产生信号的检测器。,检测器,温度影响: a、色谱柱的选择分离 b、检测器的灵敏度 c、检测器的稳定性 温度控制部分：色谱柱炉，气化室，检测器 色谱柱的温度控制方式: 恒温，程序升温。,5）控温系统,程序升温指在一个分析周期内柱温随时间由低温向高温作线性或非线性变化，以达到用最短时间获得最佳分离的目的。 分析对象：沸点范围宽的混合物,样品经色谱柱分离后，各组分按保留时间不同，顺序地随载气进入检测器检测，把进入的组分的浓度或质量按时间的变化而变化，转化成易于测量的电信号，经过必要的放大传递给记录仪或计算机，最后得到该混合样品的色谱流出曲

20、线及定性和定量信息。,6）数据处理系统和记录系统,第二节 高效液相色谱仪,一、高效液相色谱仪的流程,二、现代高效液相色谱仪的性能, 高效液相色谱系统性能的要求 ： 应用面广；分析速度快；重复性好；灵敏度高。 高效液相色谱系统的要求： 可测多种样品；有高选择性；高流动性；自动化； 高灵敏度检测器； 高效液相色谱设备的要求： 使用抗化学腐蚀的材料，有各种检测器，各种色谱柱； 高性能高压泵，进样器，检测器，管线的死体积小，有快速记录和数据处理器的设备； 可精确控制柱、温度、流动相的组成和流量； 高信噪比的检测系统。,三、高效液相色谱仪的主要部件,色谱泵,自动进样器,色谱柱及柱温箱,检测器,数据处理系

21、统,溶剂,1. 高压输液泵的一般性能,1）可重复性 是指把泵重新调到某一流量的能力，即从较高或较低流量恢复到某一特定流量的能力。 2）输出液体流量的短周期精密度 是指泵在短时间内（常指几分钟），输出液体体积恒定性的指标。精密度的变差是由于泵的某些故障所引起的。例如，往复泵的单向阀无规则地泄漏所引起的输出液体流量不稳。 3）泵噪音 一些类型的泵，如往复泵，有泵噪音是它所固有的特性，是由活塞的正常运动和单向阀的工作所引起的。 4）漂移（长周期的测量精度） 是指在较长的时间里，泵流量的连续变化的情况，往往是由于室温的变化而引起输出流量的变化。 5）准确度 是指按设定值输出准确流体的能力。,2. 输液

22、泵,1）输液泵应具备的性能： 流量精度高且稳定 流量范围宽 能在高压下连续工作 液缸容积小 密封性能好，耐腐蚀 2）输液泵操作注意事项： 防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气,四、高效液相色谱仪的检测器,紫外可见分光光度检测器应用最广的检测器 特点： 灵敏度高； 线性范围宽； 可做成很小池体积的流通； 对流动相的流速和温度变化不太敏感（灵敏度高时除外）； 易于操作，十分可靠； 不破坏样品； 波长可以选择； 对不同的溶质响应有很大的差别； 可用于梯度洗脱。,2. 示差折光检测器,1)示差折光检测器基本原理 检测基于

23、被分析物的折光指数的差异,测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别;当折光指数差异最大时灵敏度也达到最大;并不测量绝对的折光指数而是测定折光指数的差别。 2)示差折光检测器的优、缺点 a、优点：通用检测器；容易使用，通常来说是比较耐用的检测器；维护成本低。 b、缺点：灵敏度低、选择性差；对流速、温度及粘度的变化敏感；不能用于梯度方法；色谱峰可能是正的，也可能是负的。,3. 荧光检测器,荧光检测器是把荧光光度计用于高效液相色谱仪，它是一种灵敏度高、选择性好的检测器。荧光检测器的主要应用范围是生物样品、药物、食品、矿物燃料和环境样品。其特点是： 1）灵敏度高，是高灵敏液相色谱检测器之一； 2）本身

24、可产生荧光的物质，或能用有荧光基团的试剂进行衍生化的物质； 3）对有些物质的动态线性范围较小，一般为10000。 4）如用激光做激发光源可大大提高其灵敏度。,4.二极管阵列检测器,从氚等发出的紫外光通过一个消色差透镜系统，照射在流通池上，经过一个狭缝后光束照在一个全息光栅上，经色散分光后抵达一组光电二极管阵列上，在几毫秒内测定出光谱信息。其特点是： 1）可进行全波长检测，一次进样可以检测到样品中不同吸收波长下的所有组分； 2）光谱分辨率高，可以检测色谱峰的纯度； 3）灵敏度高； 4）线性范围宽； 5）基线的噪音小。,5.蒸发激光光散射检测器,蒸发激光光散射检测器运行的过程是用氮气把流动相吹成细雾状，流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉，蒸发的溶剂从检测器中被除去。溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束与光束相交，被颗粒散射的光由光电倍增管收集。 蒸发激光光散射检测器的应用领域：碳水化合物、油脂及脂肪酸、未衍生的氨基酸、制药行业、表面活性剂、天然产物。,谢谢！,