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1、1,苯唑西林耐药金黄色葡萄球分子流行病学调查 及 糖肽类抗生素对葡萄球菌体外活性研究,孙宏莉 王 辉 陈民钧,2,研究背景,3,S. aureus,Penicillin,1944,Penicillin-resistant S. aureus,Evolution of Drug Resistance in S. aureus,Methicillin,1962,Methicillin-resistant S. aureus (MRSA),Vancomycin-resistant enterococci (VRE),Vancomycin,1990s,1997,Vancomycin intermedi
2、ate S. aureus (VISA),2002,Vancomycin- resistant S. aureus,CDC, MMWR 2002;51(26):565-567,研究背景,4,苯唑西林耐药的金黄色葡萄球（MRSA）是引起医院感染的主要病因，常发生于免疫力低下的住院患者。 世界首例MRSA ：1961年，英国 目前在许多国家仍在增长：,研究背景,5,世界约100,000人/年感染MRSA 国疾病控制和预防中心（CDC）统计,研究背景,6,欧洲部分国家MRSA发生率比较,%,Tiemersma EW, et al. MRSA in Europe 1999-2002. Emerging
3、 infetious Diseases,2004,10(9)1627-1634,研究背景,7,1989-2001年美国ICU病房MRSA发病率,美国国家医院感染监测中心（NNIS）提供,研究背景,8,2001-2003年协和医院MRSA发生率比较,研究背景,9,内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌的作用机制,青霉素结合蛋白（PBP）是参与细胞壁肽聚糖成分合成的酶。-内酰胺类抗生素能与细菌胞膜的PBP结合使其失活，从而细胞壁合成受到抑制，导致细菌死亡,研究背景,10,对内酰胺类抗生素（如苯唑西林）耐药机制： 低水平耐药：产生过量的内酰胺酶、PBPs过量表达、PBP与苯唑西林亲和力下降； 高水平耐药：产
4、生由mecA基因编码的PBP2a，可替代其它PBP合成细胞壁，但与内酰胺类抗生素亲和力差，而产生耐药。 对其它抗生素耐药机制： mecA基因位于一个可移动元件SCCmecDNA，该元件由不同的整合子、转座子等组成，分别编码不同抗生素的耐药基因。,MRSA耐药机制,研究背景,11,MRSA治疗上的困难,多重耐药 有效治疗药物：万古霉素、替考拉宁、利萘唑烷、链阳霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、氯霉素等 已出现对万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌：多为MRSA 在住院患者间易传播，造成爆发流行,研究背景,12,MRSA耐药性及流行病学研究对于正确治疗其引起的感染、防止其播散有重要意义。,研究意义,13,
5、技术路线,14,从协和医院2002年住院患者分离212株MRSA（表型测定） MRSA的确证（苯唑西林盐琼脂筛选法 mecA-femB 双重PCR法) ICU、RCU病房的MRSA 耐药性检测 回顾性分子流行病学调查 （琼脂稀释法；抗生素纸片琼脂扩散法） （脉冲场凝胶电泳） 替考拉宁和万古霉素对葡萄球体外活性,技术路线,为临床正确防治并减少MRSA的感染提供参考依据,同源性分析，跟踪爆发流行趋势， 区分新生感染/复发感染、污染菌/病原菌,15,MRSA的筛选及耐药性检测,MRSA医院流行病学调查,MRSA感染病例临床资料分析,Part 1,Part 2,Part 3,16,第一部分：MRSA的
6、筛选及耐药性检测,17,MRSA的表型鉴定,MRSA的确证试验, 平板/PCR,MRSA耐药性检测,药敏结果数据分析及处理,18,一、MRSA的表型鉴定,待测菌株 革兰氏染色 触酶试验（） （阳性且呈双、链、葡萄状球菌） 胶乳凝集试验（测凝集因子、蛋白A）（） 疑难菌：API系统和VITEK系统鉴定 苯唑西林药敏试验 （抑菌圈直径 10mm）,19,二、MRSA的确证试验,mecAfemB双重PCR法,苯唑西林-盐琼脂筛选法,20,苯唑西林盐琼脂筛选试验检测MRSA,方法： （参照NCCLS M100-S13文件中的规定） 待测新鲜菌悬液（0.5号比浊管浊度） 点种于苯唑西林盐琼脂筛选平皿 （
7、含4% NaCl、6g/ml 苯唑西林的M-H平皿 ） 空气，35孵育24-48小时 生长菌落数1 检测结果：212株中有165株金葡菌在筛选平皿生长,MRSA检测,21,mecAfemB 双重PCR法检测MRSA（原理及方法）,mecA：编码PBP2a，苯唑西林耐药的决定子。 femB：某些葡萄球菌属染色体辅助基因，编码细胞壁合成所需的一种重要酶。,MRSA检测,22,mecAfemB 双重PCR法检测MRSA（原理及方法）,mecA、femB基因在不同种类葡萄球菌中的表达* MRSA MSSA MRSCoN MSSCoN mecA femB 注：MRSA苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌； MR
8、SCoN苯唑西林耐药的凝固酶阴性葡萄球菌 MSSA苯唑西林敏感的金黄色葡萄球菌； MSSCoN苯唑西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌 * JCM.May 2002,P.1821-1823,MRSA检测,23,mecAfemB 双重PCR法检测MRSA（原理及方法）,PCR扩增mecA和femB基因所用引物* 引物名 引物序列 扩增片段长度 MecA1 5-GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ATA A 3 310bp MecA2 5-CCA ATT CCA CAT TGT TTC GGT CTA A-3 FemB1 5-TTA CAG AGT TAA CTG TTA CC -3
9、651bp FemB2 5-ATA CAA ATC CAG CAC GCT CT-3 PCR产物310bp、651b处出现荧光条带为阳性 * Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1999,18:643-647.,MRSA检测,24,mecAfemB 双重PCR法检测MRSA （结果）,165株筛选平皿确证的MRSA经双重PCR法进一步确证，均为MRSA。 M: marker; 16: PCR producs of MRSA; 7: ATCC25923（MSSA）,MRSA检测,M 1 2 3 4 5 6 7,25,三、MRSA的耐药性检测（方法）,抗生素纸片琼脂扩散
10、法：万古霉素、替考拉宁、 复方新诺明、四环素 琼脂稀释法：万古霉素、替考拉宁、苯唑西林、庆大霉素、左氧氟沙星、红霉素、氯霉素 参照NCCLS M100-S13文件： 待测菌悬液：0.5号比浊管浊度 药敏培养基：M-H平皿 培养条件： 35，空气，孵育24小时 判读结果： 按NCCLS M100-S13文件规定的标准 数据分析及处理：WHONET-5.3软件,MRSA检测,26,MRSA的耐药性检测（结果1）,165种MRSA对9种抗生素的药敏结果：,抗生素 R% I% S% MIC50 MIC90 MIC值范围,苯唑西林 100 0 0 64 64 32-64 替考拉宁 0 0 100 2 2
11、 0.5-8 万古霉素 0 0 100 0.5 1 0.25-2 庆大霉素 100 0 0 256 512 32-512 红霉素 93.9 1.8 4.2 128 128 125-128 氯霉素 0.6 0.6 98.8 8 8 4-64 左氧氟沙星 98.2 1.8 0 16 32 4-128 甲氧苄啶 3.6 0.6 95.8 /磺胺甲恶唑 四环素 96.3 1.2 2.5,耐药性检测,27,MRSA的耐药性检测（结果2）,MIC法测定的万古霉素和替考拉宁对165株MRSA的MICs的散点图,耐药性检测,28,第二部分：MRSA医院流行病学调查 （ICU、RCU病房）,29,脉冲场凝胶电泳
12、（PFGE）,耐药表型和基因型比较,30,一、MRSA的脉冲场凝胶电泳（原理）,PFGE,31,MRSA的脉冲场凝胶电泳（结果分型2）,1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14,2002年ICU及RCU病房MRSA主要流行株(A1亚型) 114 lanes: A1亚型（共55株）; M: ladder marker,PFGE,32,MRSA的脉冲场凝胶电泳（结果判读）,PFGE,CDC Tenover *等人推荐的方法判读：,突变位点数 酶切后DNA片断区别 亲缘关系 基因分型,0 无区别 同型 1 2-3条 亲缘关系密切 同型但不同亚型 2 4-6条 可能存在亲缘
13、关系 同型但不同亚型 3 7条 无亲缘关系 不同型,1. * Tenover FC,JCM,1995,33:2233-2239.,33,MRSA的脉冲场凝胶电泳（结果分型1）,5种：A（A1、A2）、B（B1、B2、B3）C、D、E型,ICU及RCU病房65株MRSA 的PFGE图谱,M A1 A2 B1 B1 B2 B2 B3 D D C E M,PFGE,34,MRSA部分病例调查结果（三）,A1亚型爆发流行株（55/65株）分离时间遍布2002全年,临床资料,35,二、MRSA的耐药表型和基因型比较,不同基因型（不同克隆来源）,相同耐药谱,表型与基因型,36,序号 病房 分离时间 标本类
14、型 耐药谱 PFGE分型,1 RCU 2002-2-1 痰 OGLER A1 2 ICU 2002-8-1 痰 OGLER A1 3 ICU 2002-10-3 痰 OGLER A1 4 ICU 2002-10-8 痰 OGLER A1 5 ICU 2002-10-14 痰 OGLER A1 6 ICU 2002-1-2 血液 OGLER A1 7 ICU 2002-1-8 痰 OGLER A1 8 ICU 2002-2-4 痰 OGLER A1 9 ICU 2002-4-8 痰 OGLER A1 10 ICU 2002-4-10 导管 OGLER A1 11 ICU 2002-10-3 痰
15、OGLER A2 12 RCU 2002-10-3 痰 OGLER B1 13 RCU 2002-1-14 痰 OGLER B1 14 RCU 2002-6-2 痰 OGLER B2 15 RCU 2002-12-2 痰 OGLER B2 16 ICU 2002-2-5 腹水 OGLER B3 17 RCU 2002-5-10 导尿管 OGLER C 18 RCU 2002-11-10 痰 OGLER D 19 ICU 2002-7-4 痰 OGLER D 20 ICU 2002-3-2 痰 OGLER E,表型与基因型,注：O苯唑西林、G庆大霉素、L左氧氟沙星、E红霉素、R四环素,37,MR
16、SA的脉冲场凝胶电泳（结果小结）,ICU和RCU病房2002全年都在流行着A1亚型MRSA。 耐药谱分型与PFGE分型可不一致。,38,第三部分：临床资料分析,39,本研究MRSA为多重耐药，基因分型同源性高，造成治疗困难。 为找到合理使用抗生素策略及爆发流行源头和传播途径，对部分病例进行了回顾性调查分析，结果发现：,临床资料,40,MRSA部分病例调查结果（一）,调查项目 调查结果 疾病 严重感染12/30; 癌症7/30; 多器官功能衰竭6/30; 心、肺、 肾衰各1/30 年龄 20岁以下1/35; 20-40岁4/35; 40-70岁21/35; 70岁以上9/35 标本来源 痰51/
17、65; 血液4/65; 导尿管3/65; 支气管刷、洁尿各2/65；其它3/65 器械治疗 呼吸机17/30；置管18/30；大手术11/30,临床资料,41,MRSA部分病例调查结果（二）,调查项目 调查结果 抗菌素使用史 25/30住院期间使用过第三、四代头孢菌素、氟喹诺酮类、碳青霉烯类等广谱抗生素。 改用万古霉素或替考拉宁后转归 MRSA所致感染好转者占23/29； 未好转者6/29 同一患者不同分离株时间间隔 8/65采集到不止一株MRSA（间隔至少二周，其中一位长达半年）。 MRSA分离时间 2002年1月12月间无明显波动,临床资料,42,第四部分：替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌,的
18、体外活性检测,43,替考拉宁和万古霉素对葡萄球体外活性检测 （方法）,测定替考拉宁和万古霉素的MIC及抑菌圈直径 （琼脂稀释法、K-B法）,不同种葡萄球菌 （MRSA、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌）,不同接种浓度菌液 （104 cfu、106 cfu）,活性区别,对MIC结果的影响,琼脂稀释法与抗生素纸片扩散法药敏结果的相关性,44,替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌体外活性检测（结果1）,不同接种浓度菌液对二种抗生素外活性影响 二种抗生素对不同葡萄球菌的活性区别,45,替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外活性检测（结果2）,TEC、VAN对葡萄球菌的MIC法与纸片扩散法之间的相关性,46,替考拉宁和万
19、古霉素对葡萄球菌的体外活性检测（结果小结）,47,讨 论,48,MRSA引起的医院感染与治疗（一）,是医院感染主要病因，常发生抵抗力低下的住院患者。 可引起住院患者的长期感染，不易消除。 爆发流行主要途径： 共用的医疗器械（如呼吸机）、 MRSA携带者 （患者、医护人员等）,讨论,49,MRSA引起的医院感染与治疗（二）,抗生素选择压力下的后果。 使用或改用合理抗生素治疗： 多数病人迅速好转； 抗生素治疗无效组：病人身体状况太差，药物很难到达有效部位或到达有效部位的抗生素浓度不足，不能完全杀灭耐药菌。,讨论,50,替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外抗菌活性,替考拉宁 受多种因素影响： 在琼脂中
20、扩散系数 接种菌量 以K-B法检测的替考拉宁耐药菌株，应进一步测定其MIC。 通常敏感株 金黄色葡萄球菌 不稳定敏感株 凝固酶阴性葡萄球菌（如溶血葡萄球菌）： 细胞膜39kD的蛋白质，阻碍替考拉宁与靶位的结合。 万古霉素 对葡萄球菌活性较稳定，但对肠球菌活性较差。,讨论,51,结论,MRSA耐药性特点,万古霉素和替考拉宁高敏100,复方新诺明和氯霉素敏感率较高,其它所测抗生素多重高耐,2002年ICU、RCU病房发生了A1基因型MRSA流行,MRSA流行病学调查,52,治疗及预防MRSA感染及爆发流行的关键：,合理使用抗生素,加强消毒隔离观念,正确的药敏实验,53,MRSA的检测,54,MRS
21、A ：homoMRSA MIC100mg/l hetero-MRSA MIC 1-100mg/l 生长缓慢，常规检测易漏检,55,PBP2a的表达,mecA FOX：better inductor of mecA OXA：weak inductor of mecA,56,OXA (1ug) FOX(30ug) MRSA 30 100% 100% 35 93.3% 94.7% MRCNS 30 100% 100% 35 100% 100% 最佳检测方法FOX(30ug) 30 ,57,FOX（K-B)筛选MRSA,20mmMRSA 20-23mm中度敏感 PCR、乳胶凝集试验 24mmMSSA,58,谢谢！,