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1、实验三 测定蛋白质的比色分析法,双缩脲法,Lowry氏法,教师：王丽华,实验目的,1. 掌握双缩脲法及Lowry氏法测定蛋白 浓度的原理; 2. 学会使用分光光度计;,实验原理,1、分光光度法及比色分析法,2、Lambert-Beer定律,3、颜色反应,分光光度法及比色分析法,应用分光光度计测定溶液的吸收光谱及其对某一波长光线的吸收能力，可以作为物质定性或定量检查的方法,称为分光光度法。,紫外分光光度法 比色分析法（可见光分光光度法） 红外光谱法 荧光光度法 化学发光分析法,分类：,一、物质对光的选择性吸收和吸收光谱,（一）物质的颜色和光的波长的关系,光是一种电磁波； 自然光是由波长不同的电磁
2、波组成的混合光，在400-760nm范围。,光的互补色示意图(/nm),物质的颜色实质是它所吸收的色光的互补色。,实验证明： CuSO4溶液浓度越高，对黄色光的吸收越 多，表现为透过的蓝色越强，溶液的蓝色也越深。 比较溶液颜色的深浅，实质比较溶液对光的吸收程度,互补色光如：黄光和蓝光；紫光和绿光。,（二）吸收光谱曲线,吸收光谱曲线 横坐标；纵坐标A。 最大吸收波长 max 同种物质： C不同，max相同,max,二、Lambert-Beer定律,I,I0,单色光,透光度 T= I / I0,D = Lg I/I0=KCL,D值：光密度（ OD.） 表示溶液对光线的吸收量。 亦称为吸收度 （A）
3、 C：溶液的浓度 L：溶液的厚度 K：常数，称为消光系数 表示物质对光线吸收的本领 取决与物质的种类和波长。,D =KCL,单色光 稀溶液 吸收峰值(max) 稳定的溶液,Lambert-Beer定律的适用条件,三、比色分析法,许多物质本身具有一定的颜色，也有许多物质本身无颜色在加入适当的显色剂后生成有色物质。 溶液浓度越大，颜色越深。因此可以利用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。 比色分析法：用可见光光源测定有色物质，也称为可见光分光光度法。,以Lambert-Beer定律为基础,比色分析法,当溶液的厚度不变 (L) 对于同一物质和同样波长的单色光，即消光系数不变(K) 溶液的光密
4、度和溶液的浓度成正比。 即： D1/D2=C1/C2,D =KCL,1、标准管法：D1/D2 = C1/C2 （比色分析法的依据 ） 2、标准曲线法：分析大批样品时。 3、利用消光系数计算。,计算方法：,分光光度计,光源,单色光器,吸收杯,测光机构,操作一 Lowry氏法测定蛋白质含量 标准曲线法,1、 实验原理 2、 操作步骤 3、计算方法 4、试剂及器材,操作二 双缩脲法测定血清总蛋白 计算法,3、计算方法,1、反应原理,2、实验步骤,4、试剂及器材,实验十二 血清脂蛋白的琼脂糖 凝胶电泳,理论知识,血浆脂蛋白,血脂与血浆中的蛋白质结合，以脂蛋白形式而运输。 血脂包括：TG、ch和FFA等
5、 蛋白质：载脂蛋白(apolipoprotein),乳糜微粒 CM 极低密度脂蛋白 VLDL 低密度脂蛋白 LDL 高密度脂蛋白 HDL,血浆脂蛋白的分类,血浆脂蛋白的结构,疏水性较强的TG及胆固醇酯位于内核。,具极性及非极性基团的载脂蛋白、磷脂、游离胆固醇，以单分子层借其非极性疏水基团与内部疏水链相联系，极性基团朝外。,电泳的基本原理,1、概念,指带电颗粒在电场中向着与其所带相反电荷的电极移动的现象。,2、迁移率（泳动度） 带电颗粒在单位电场中泳动的速度。,3、影响电泳速度的因素,内在因素: 样品自身性质（大小、形状、电荷） 外在因素: 电场（电压、电流、电阻） 缓冲液（离子强度、pH值）
6、支持介质,4、脂蛋白电泳的基本原理,各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小、带电荷的数量相差也很大，因此以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。,实 验 操 作,37水浴中染色30分钟,血清：0.2ml 苏丹黑染色液0.02ml,摇 匀,1、预染血清,离心（4000转分）约5分钟,2、制备琼脂糖凝胶板 将0.5%琼脂糖凝胶于微波炉中加热融化, 浇注到电泳槽内，静止待其凝固。,3、加样:预染血清20微升 (注意:不要吸取底部的染料颗粒),4、电泳:样品放于阴极一端。接通电源，恒压电泳100V约30分钟，即可见到分离的区带。 5、观察并记录电泳结果,CM 前 ,血浆脂蛋白的电泳图谱,VLDL,LDL,HDL,正常参考值（百分比）： -脂蛋白 25.74.1%(HDL) 前-脂蛋白21.04.4%(VLDL) -脂蛋白 53.35.3%(LDL),