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1、第十二章 微生物的分类和鉴定,形成于35亿年前的微生物化石 主要是些类似简单杆状细菌的原始生物,形成于8.5亿年前的微生物化石,20亿年前以后的岩石中的微生物的化石形态多样性明显增多,形成于10亿年前的微生物化石,形态上非常类似于现代的蓝细菌， 进行不产氧光合作用的光能自养 菌，及化能无机营养的硫细菌。,形态上类似于现代的绿藻（真核生物）,今天仍生存在地球上的生物种类， 彼此之间都有或远或近的历史渊源。,最原始的生命,漫长的进化历程,千姿百态的生物种类,生物分类的二种基本原则：,a）根据表型(phenetic)特征的相似程度分群归类，这种 表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生 物亲缘关
2、系为目标；,b）按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标 是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系 统发育的分类系统。,从进化论诞生以来，已经成为生物学家普遍接受的分类原则,生物系统学(systematics),进化的测量指征,rRNA作为进化指征, 生物功能：rRNA参与蛋白质的合成。 分子结构：序列中既存在高度保守的区域，也存在高度变化区域。其中16S rRNA大小适合，操作方便。 数量与分布：数量大，普遍存在于原核和真核生物中。,利用16S rDNA序列对微生物进行鉴定,利用16SrRNA建立分子进化树的美国科学家 Carl Woese,微生物的16Sr DNA序列具有进化上的保
3、守性，因此可作为分类的良好依据。,基于16S rDNA序列同源性的脱氮细菌系统发育树,培养微生物,提取基因组DNA,rRNA序列测定,分析比较,微生物之间的系统发育关系,16S rDNA微生物鉴定流程,PCR扩增16S rDNA片段,第一节 细菌分类,分类是认识客观事物的一种基本方法。我们要认识、 研究和利用各种微生物资源也必须对它们进行分类。,分类(classification)：根据一定的原则(表型特征相似性或系统发育 相关性)对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成 系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的 微生物进行鉴定；,(根据现有数据建立系统的过程),分
4、类学涉及三个相互依存又有区别的组成部分：,鉴定,分类、,命名、,命名(nomenclature)：是根据命名法规，给每一个分类群一个专有 的名称；,(分类系统建立过程中的步骤之一),鉴定(identification或determination)：借助于现有的微生物分类 系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类 地位的微生物所应归属分类群的过程。,(根据现有系统确定未知微生物分类归属的过程),主要以细菌为例介绍微生物分类、命名和鉴定的有关知识,常用的细菌分类学术语：,1）培养物(culture)：一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长 物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。,
5、2）菌株(strain)：从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养 物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法(如通过诱变) 所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株， 以便与原来的菌株相区别。,菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体,一、分类单元及其等级,3）型(form或type)：常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌 株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。,例如抗原特征的差异分为不同的血清型；对噬菌体裂解反应的 不同分为不同的噬菌型等。,4）种（species）： 物种，生物分类中基本的分类单元和分类等级。,高等生物中，“生殖隔离”被看作是区分物种
6、的标准。,微生物的种：具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其 他类群的菌株有很明显的区别。,伯杰氏手册,伯杰氏鉴定细菌学手册 (Bergeys Manual of Determinative Bacteriology),美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937),1957年第七版后，由于越来越广泛地吸收了国际上细菌分类学家参加编写(如1974年第八版，撰稿人多达130多位，涉及15个国家；现行版本撰稿人多达300多人，涉及近20个国家)，所以它的近代版本反映了出版年代细菌分类学的最新成果，因而逐渐确立了在国际上对细菌进行全面分类的权威地位。,伯杰氏系统细菌
7、学手册 (Bergeys Manual of Systematic Bacteriology),伯杰氏手册是目前进行细菌分类、鉴定的最重要 依据，其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属 种的特征及进行鉴定所需做的实验的具体方法。,（20世纪80年代末期）,二、微生物的命名,双名法，属名和种名加词组成，一般用斜体表示。,属名在前，一般用拉丁字名词表示，字首字母大写,种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写,若所分离的菌株只鉴定到属，而未鉴定到种，可用sp来表示，,例如 Bacillus sp,Pseudomonas aeruginosa,铜绿假单孢菌,二、微生物的命名,由于细菌分类单元的划分缺乏
8、一个易于操作的统一标准， 为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱， 细菌系统分类也像其他生物分类一样采用“模式概念”,种和亚种指定模式菌株（type strain）；,亚属和属指定模式种（type species）；,属以上至目级分类单元指定模式属（type genus）；,模式菌株应送交菌种保藏机构保藏，以便备查考和索取。,第二节、细菌分类鉴定的特征和技术,在现代微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料， 都有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。,形态学特征、,生理学特征、,生态学特征,从不同层次(细胞的、分子的)，用不同学科(化学、物理学、 遗传学、免疫学、分子生物学等
9、)的技术方法来研究和比较 不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现的反 映微生物类群特征的资料。,生物分类的传统指标：,一、形态学特征,培养特征、,运动性、,特殊的细胞结构、,细胞形态及其染色特性、,等等,微生物分类和鉴定的重要依据之一：,a）易于观察和比较，尤其是真核微生物和具有特殊 形态结构的细菌；,b）许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对 的稳定性；,二、生理生化特征,与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关；,代谢产物等,营养类型；,与氧的关系；,对温度的适应性；,对pH的适应性；,对渗透压的适应性；,酶及蛋白质都是基因产物；,对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因
10、组的间接比较；,测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多；,二、生理生化特征,在以实用为主要目的表型分类中，生理生化特征往往是细菌分类鉴 定的主要特征。肠道菌科细菌属和种的分类鉴定就是如此。,形态和生理生化特征是最常用 的细菌分类、鉴定指标,三、核酸的碱基组成和分子杂交,特点：,与形态及生理生化特性的比较不同，对DNA的碱基 组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微 生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。,1. DNA的碱基组成(G+Cmol%),DNA碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别 基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。,分类学上，用G+C占全部碱基的克分子百分数(G+
11、Cmol%) 来表示各类生物的DNA碱基因组成特征。,1）每个生物种都有特定的GC%范围，因此后者 可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围 为25-75%，变化范围最大，因此更适合于细 菌的分类鉴定。,2）GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌 作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性， 从分子水平上判断物种的亲缘关系。,3）使用原则：,G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定,每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物， 它们应该具有相似的G+C含量，若不同生物之间G+C含 量差别大表明它们关系远。,但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们 之间具有近的亲缘关系。,80年代以前螺菌属
12、(Spirillum)不同种的G+C含量范围宽达3866%， 后来“伯杰氏手册”(1984)结合其他特征已将其分成三个属：螺菌属、 海洋螺菌属(Oceanospirillum)和水螺菌属(Aquaspirillum) 它们G+C含量分别为38%、4251%和4966%；,过去根据形态学特征曾认为微球菌属(Micrococcus)和葡萄球菌属 (Staphylococcus)是关系很近的两个属，因而长期放在一个科内， 由于G+C含量的差异(分别为3038%和6475%)表明它们亲缘关 系相当远，现在根据16SrRNA序列资料已进行新的调整。,2. 核酸的分子杂交,不同生物DNA碱基排列顺序的异同
13、直接反映生物之间 亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间 的亲缘关系就越近，反之亦然。,直接分析比较DNA的碱基排列顺序,-由于技术上的困难目前尚难以普遍地进行；,核酸分子杂交(hybridization)间接比较不同微生物DNA,碱基排列顺序的相似性,特异性的探针主要用于 病原微生物的快速鉴定,四、其它,血清学试验、噬菌体分型、生态特性、氨基 酸顺序和蛋白质分析、对细胞壁等细胞成分 的分析比较、通过原核生物的转化、转 导、接合来判断原核生物的亲缘关系等等。,BIOLOG自动微生物鉴定系统,BIOLOG公司以其专利技术开发的微生物鉴定系统，以检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的酶与四唑类物质（如TTC、TV）发生颜色反应和浊度差异为基础，运用独有的显型排列技术检测出每种微生物的特征指纹图谱，在大量试验和数学模型基础上，建立起指纹图谱与微生物种类相对应的数据库。检测时通过智能软件将待鉴定微生物的图谱与数据库参比，即可得出鉴定结果。,检测原理,鉴定步骤,分离纯化,平板扩大培养,制备菌悬液,调整浊度,接种培养,获取结果,鉴定的微生物种类与所耗时间,