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1、微生物的遗传育种技术,理想的工业发酵菌种应符合以下要求：,遗传性状稳定； 生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染； 目标产物的产量尽可能接近理论转化率； 目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离； 尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离； 培养基成分简单、来源广、价格低廉； 对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感； 对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。,微生物的独特生物学特性：,（1） 个体的体制极其简单； （2） 营养体一般都是单倍体； （3） 易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖； （4） 繁殖速度快； （5） 易于积累不同的中间代谢产物或终产
2、物； （6） 菌落形态特征的可见性和多样性； （7） 环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性； （8） 易于形成营养缺陷型； （9） 各种微生物一般都有相应的病毒； （10） 存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；,微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。 对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。,研究微生物遗传学的意义,遗传与变异的概念,遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。 遗传(he
3、redity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。 遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；-是一种内在可能性或潜力。 遗传型 + 环境条件 表型 表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;-是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。,变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点：a.在群体中以极低的几率出现，（一般为10-610-10）；b.形状变化的幅度大； c. 变化后形成的新性状
4、是稳定的，可遗传的。 饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。,例如：粘质沙雷氏菌：在25下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25，又恢复产色素的能力。,遗传与变异的概念,第一章 遗传变异的物质基础,种质连续理论：18831889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。 基因学说：1933年摩尔根（Thomas Hunt
5、 Morgan）发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。 但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列核组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，其活性成分是蛋白质。 DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验），才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物
6、质。,（一）核酸存在的七个水平及质粒 细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核 细胞核水平: 原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA 染色体水平: 倍性(真核)和染色体数 核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链 基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录翻译 密码子水平： 信息单位,起始和终止, 核苷酸水平： 突变或交换单位，四种碱基,一、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,二、原核生物的质粒,定义：是一类小型闭合环状核外双螺旋DNA分子，能独立于细胞核进行自主复制。 大小：约为2100106Dalton，上面携带有数个到数十个
7、甚至上百个基因。 性质： 可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在； 质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（15）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10200个或更多。,可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移
8、，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。 对于细菌的生存并不是必要的 功能多样化,二、原核生物的质粒,功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。 重组：在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生。 存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等 制备：包括增殖、裂解细胞、去除RNA和蛋白质等成分、分离质粒与染色体DNA等步骤。 鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法,二、原核生物的质粒,几种代表性质粒：,1. F因子（fertil
9、ity factor）：又称致育因子或性因子，62106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。 R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因
10、子（r-determinant），RTF为分子量约为11106Dalton，控制质粒copy数及复制，转移。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100106Dalton以上，其上带有其它抗生素的抗性基因。 R-因子在细胞内的copy数可从12个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个/细胞。,2. R因子（resistence factor）,细菌素 产大肠杆菌素因子。 大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约41048104Dalton。大肠杆菌素都是由Col因子编码
11、的。 Col因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。 ColE1分子量约为5106Dalton，无接合作用，是多copy的； ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 的研究和用于体外复制系统上。 ColIb分子量约为80106Dalton，它与F因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有12个copy。 凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,3. Col因子（colicinogenic factor）,降解性质粒 只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌
12、所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,4. 降解性质粒,即诱癌质粒。 存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌 。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。 Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究
13、中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。,5. Ti质粒（tumor inducing plasmid）,是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200300106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,6. 巨大质粒（mega质粒）,第二章 基因突变和诱变育种,突变（ mutation ）：指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。 染色体畸变细胞学上可以看到染色体的变化 突变 基因突变细胞学上看不到遗传物质的
14、变化 突变体（mutant）：发生了突变的微生物细胞或菌株 野生型（wild type）：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株,依表型的改变分为： 形态突变型个体和菌落形态的变异 营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。 发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型 抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性 条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型 抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变 产量突变型,（一）基因突变的类型,按是否比较容易、迅速地分离到发生
15、突变的细胞来分： 选择性突变株（selective mutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。 非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。,定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 突变率为108是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其
16、分裂为2108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是108 。 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数 突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。 由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用特殊手段筛选突变株加以确定。,（二）突变率,若干细菌某一性状的自发突变率,菌 名 突变性状 突变率 E. coli 抗T1噬菌体 3 108 E. coli 抗T3噬菌体 1 107 E. coli 不发酵乳糖 1 1010 E. coli 抗紫外线 1 105 Staphylococcus aure
17、us 抗青霉素 1 107 S. aureus 抗链霉素 1 109 Salmonella typhi 抗25g/L链霉素 1 106 Bacillus megaterium 抗异烟肼 5 105,（三）突变的特点,适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。 不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。 自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。 稀有性：突变率低且稳定。 独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。 可诱发性：诱变剂可提高突变率。 稳定性：变异性状稳定可遗传。 可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突 变（forward mutation），从突变株回到野
18、生型的 过程则称为回复突变或回变（back mutation或 reverse mutation）。,（四）基因突变的自发性和不对应性的证明,在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。 一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。 另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。 从1943年起，经过几个严
19、密而巧妙的实验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争。,变量试验又称波动试验或彷徨试验。 1943年，S. E. Luria 和M. Delbrck 根据统计学原理，设计了左方的实验。,1. 变量试验fluctuation test,2.涂布试验,原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。,涂布试验中突变率的计算,初始接种量：5 104 个/皿 培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌 这时，每个平皿上的细胞数为： 5100 5 104 2.6 108个/皿 在6个平板上，比接种时增加的细胞数为： 6 （2.6 108 5 1
20、04）= 15.6 108 在未涂布的平板上共发现28个突变，故 突变率 = 28/15.6 108 = 1.8 108,3. 平板影印培养试验（replica plating）,1952年，J. Lederberg夫妇的论文平板影印培养法和细菌突变株的间接选择，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。 平板影印培养法，是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法：把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这
21、些平板培养后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。据报道，用此法可把母平板上1020%量的细菌转移到丝绒布上，并可利用这一“印章”接种8个子培养皿。因此，通过影印培养法，就可以从在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变株。,平板影印培养法,在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用。 平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种时间和其它研究中均有应用，值得很好地领会。,（五）基因突变的机制,基因突变的原因是多种多样的，可以是自发的或诱发的，诱变又可分为
22、点突变和畸变。具体类型可归纳如下：,1. 诱变机制,诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂 种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。 按照遗传物质结构变化的特点讨论几种有代表性的诱变剂的作用机制。,（1）碱基置换（substitution）,定义：对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（point mutation）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。 分类：转换（transition），即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换； 颠换（transv
23、ersion），即一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。,对某一具体诱变剂来说，即可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。,直接引起置换的诱变剂,定义：一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。 种类：很多。例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。 作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。 羟胺只引
24、起GCA : T， 其余都是可使GC=A : T发生互变的。 能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有.,亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。 HNO2 胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U） HNO2 腺嘌呤（A） 次黄嘌呤（H） HNO2 鸟嘌呤（G） 黄嘌呤（X） 这些反应及形成物均可在DNA复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。,碱基转换的分子机制以亚硝酸为例,腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤（H）后引起的转换过程：,腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（He） He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK） DNA复制时，HK 与胞嘧啶（C）配对 DNA第二次复制时，C与G正常配对，实现了转换。,亚硝酸引
25、起的AT-GC转换细节,这类诱变剂主要是一些碱基类似物 ,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5AU）、叠氮胸腺嘧啶（AIT）等等； 作用方式：通过活细胞的代谢活动参入到DNA分子中，主要是在DNA复制时碱基类似物插入DNA中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。 以5-溴尿嘧啶(5-BU)为例： 5-BU是胸腺嘧啶（T）的 的类似物 ，酮式的5-BU可以和A配对，烯醇式的5-BU 可以和G配对，在DNA分子复制的过程中，由于5-BU的插入和互变异构导致碱基置换。,间接引起置换的诱变剂,5-BU引起的转换,5-BU引起的转换,从上图中，还可以看到5-BU的掺入引起的GC回复到AT的过程
26、。通过这两个图示，就很容易理解为什么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了。 也可以知道，为什么像5-BU这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的DNA分子却不起作用。,（2）移码突变,frame-shift mutation 或 phase-shift mutation，指诱变剂使DNA分子中增加（插入）或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。 由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame-shift mutant）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DN
27、A分子的微小损伤。 丫啶类染料，包括原黄素、丫啶黄、丫啶橙和-氨基丫啶等，以及一系列称为ICR类的化合物，都是移码突变的有效诱变剂。,图8-14能诱发移码突变的几种代表性化合物,引起移码突变的诱变剂：主要是吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙等等。 这类化合物都是平面型的三环分子，它们的结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似。,丫啶类化合物的诱变机制：,至今还不很清楚。 有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失
28、一个碱基，结果就引起了移码突变。,丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示：,（3）染色体畸变（chromosomal aberration）,某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）染色体畸变，它包括： 染色体结构上的变化： 缺失（deletion） 重复（duplication） 易位（translocation） 倒位（inversion） 染色体数目的变化,染色体结构上的变化,分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。 染色体内畸变：只涉及一条染色体上的变化， 如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减
29、少或增加； 如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。 倒位-是指断裂下来的一段染色体旋转180后，重新插入到原来染色体的原位置上，从而使其基因顺序与其它的基因顺序相反； 易位-是指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。 染色体间畸变：指非同源染色体间的易位。,染色体畸变,转座因子（transposible element）,由40年代B. McClintock对的遗传研究而发现染色体易位，自1967年以来，已在微生物和其它生物中得到普遍证实，并已成为分子遗传学研究中的一个热点。 旧概念：基因是固定在染色体DNA上的一些不可移动的核苷酸片段。
30、 新发现：有些DNA片段不但可在染色体上移动，还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳到另一个质粒或染色体，甚至还从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA顺序的跳跃过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。 转座因子（transposible element）：在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序。也称作跳跃基因（jumping gene）或可移动基因（movable gene）。,转座因子的种类（1）,插入序列（IS，insertion sequence）：特点是分子量最小（仅0.71.4kb），只能引起转座（t
31、ransposition）效应而不含其它基因。可以在染色体、F因子等质粒上发现它们。已知的IS有5种，即 IS1、IS2、IS3、IS4和IS5。E . coli的F因子和核染色体组上有一些相同的IS（如IS2，IS3等），通过这些同源序列间的重组，就可使 F因子插入到E . coli的核染色体组上，从而使后者成为Hfr菌株。因IS在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS引起的突变可以回复，其原因可能是IS被切离，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变。,转座因子的种类（2）,转座子（Tn，transposon，又称
32、转位子，易位子）：与IS和Mu噬菌体相比，Tn的分子量是居中的（一般为225kb）。它含有几个至十几个基因，其中除了与转座作用有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发酵基因等其它基因。Tn虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但这些位点似乎也不完全是随机的，其中某些区域更易插入。,转座因子的种类（3）,Mu噬菌体（即 mutator phage，诱变噬菌体）：它是E . coli的一种温和噬菌体。与必须整合到宿主染色体特定位置上的一般温和噬菌体不同，Mu噬菌体并没有一定的整合位置。与以上的IS和Tn两种转座因子相比，Mu噬菌体的分子量最大（37kb），它含有20多个基因。Mu噬菌体引起的转座可以引起
33、插入突变，其中约有2%是营养缺陷型突变。,若干诱变剂的作用机制及诱变功能,诱变因素 在DNA上的初级效应 遗传效应 碱基类似物 掺入作用 AT=GC双向转换 羟 胺 与胞嘧啶起反应 GCAT的转换 亚硝酸 A、G、C的氧化脱氨作用 AT=GC双向转换 交 联 缺失 烷化剂 烷化碱基（主要是G） AT=GC双向转换 烷化磷酸基团 ATTA的颠换 丧失烷化的嘌呤 GCCG的颠换 糖-磷酸骨架的断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位） 丫啶类 碱基之间的相互作用（双链变形） 码组移动（或） 紫外线 形成嘧啶的水合物 GCAT转换 形成嘧啶的二聚体 码组移动（或） 交 联 电离辐射 碱基的羟基化核降解
34、 AT=GC双向转换 DNA降解 码组移动（或） 糖-磷酸骨架的断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位） 丧失嘌呤 加热 C脱氨基 CGTA转换 Mu噬菌体 结合到一个基因中间 码组移动,2.自发突变机制,自发突变是指在没有人工参与下生物体自然发生的突变。 几种自发突变的可能机制 微生物自身有害代谢产物的诱变效应： 过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物。它对Neurospora（脉孢菌）有诱变作用，这种作用可因同时加入过氧化氢酶而降低，如果在加入该酶的同时又加入酶抑制剂KCN，则又可提高突变率。这就说明，过氧化氢很可能是“自发突变”中一种内源性诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自
35、发突变株，可能也是同样的原因。 由背景辐射和环境因素引起：天然的宇宙射线,互变异构效应：,碱基T、G的第六位上是酮基，会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现 C、A的第六位上是氨基，会以氨基式或亚氨基式两种互变异构的状态出现 平衡一般趋向于酮式或氨基式，在DNA双链结构中一般总是以AT和GC碱基配对的形式出现 在偶然情况下，在DNA复制到达这一位置的瞬间，在T以稀有的烯醇式出现时，其相对位置上就出现G 同样，如果C以稀有的亚氨基形式出现在DNA复制到达这一位置的瞬间，则在新合成DNA单链中与C相对应的位置上就将是A。这可能就是发生相应的自发突变的原因。 要预言在某一时间、某一基因发生自发突变是
36、不可能的。在运用数学方法对这些偶然事件做大量统计分析后，可以发现并掌握其中的规律。例如，据统计，碱基对发生自发突变的几率约为10 8 10 9。,（六）紫外线对DNA的损伤及其修复,已知的DNA损伤类型很多，机体对其修复的方式也各异。发现较早和研究得较深入的是紫外线（U.V.，ultraviolet ray）的作用。 嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。 紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有
37、可能引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。,光复活作用（photoreactivation）,定义：经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。 这一现象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomyces griseus（灰色链霉菌）中发现的。后来，在许多微生物中都得到了证实。最明显的是在E.coli的实验中： 对照：8106个/ml E.coli U.V. 100个/ml E.coli 试验：8106个/ml E.coli U.V. 360490nm
38、 2106个/ml E.coli 可见光，30分 经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会被一种光激活酶（photoreactivating enzyme）即光裂合酶（photolyase）结合，当形成的复合物暴露在可见光（300500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。与此同时，光激活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行功能。每一E.coli细胞中约含有25个光激活酶分子。 由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液。,图:光复活作用,暗修复作用（dark repair）,又称切除修
39、复（excision repair）。是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂（包括烷化剂、X射线和射线等）损伤后的DNA的机制。这种修复作用与光无关。有四种酶参与内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5一侧切开一个3-OH和5-P的单链缺口；外切核酸酶从5-P至3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口；DNA聚合酶以DNA的另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起逐个延长，重新合成一段缺失的DNA链；通过连接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3-OH末端与原链的5-P末端相连接，从而完成了修复作用。,暗修复作用（dark repair）,1、由核酸内切酶切开二聚体的5末端，形成3-OH和5-P的单链缺口
40、2、核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。 3、DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段。 4、连接酶将新合成的3-OH与原有的5-P相连接。,诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,（七）诱变育种,诱变育种的步骤：,原始菌种,纯化,斜面/肉汤培养,单孢子/单细胞悬液,诱变剂处理,平板分离,移至斜面,小
41、试,中试,初筛,复筛,计算存活率,观察形态变异，挑单菌落,良种保藏,原菌种特性鉴定,1.出发菌株的选择： 出发菌株用来育种处理的起始菌株 出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力； 出发菌株的来源； 自然界直接分离到的野生型菌株： 历经生产考验的菌株： 已经历多次育种处理的菌株：,2.制备细胞悬液 要求： 菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长； 细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypic lag）; 方法： 玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80（表面活性剂） 用无菌脱脂棉过滤。 浓度： 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 10
42、6个/ml,表型迟延现象：指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。 产生原因： 分离性迟延现象 生理性迟延现象,3.诱变处理： 诱变剂的作用： 提高突变的频率 扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动 剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。 最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在7080%）,诱变剂剂量一般指强度与作用时间的乘积。各种诱变剂有不同的剂量表示方式，如化学诱变剂以一定
43、温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂的相对剂量。 诱变剂的合适剂量：凡在提高诱变率的基础上，能扩大变异幅度，促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。 要确定一个合适的剂量，常常要经过多次试验。就一般微生物而言，在一定的剂量范围内，突变率往往随剂量的增高而提高，但正变较多出现在偏低的剂量中，而负变则较多出现在偏高的剂量中；还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。因此，在诱变育种工作中，目前大家比较倾向于采用较低的剂量。,选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理
44、诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。,紫外诱变方法:,设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等， 紫外灯：波长为253.7nm, 功率是15W 处理时的照射距离：20cm 30cm 样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm 照射时，要用磁力搅拌器搅拌。 处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量。,由于微生物接受的照射剂量与灯的功率、照射距离、照射时间、菌液浓度、菌液厚度、细胞本身特性等因素有关，所以单纯用时间表示照射剂量并不完全可靠。一定的死亡率必定对应一定的照射剂量，所以，在实际应用中，用死亡率表示照射剂量更可靠。 通常先绘制照
45、射时间与死亡率的关系曲线，然后选择合适的剂量。 生产上经常采用的剂量： 死亡率为70%80%左右。,艾姆斯试验测定潜在化学致癌物的基本原理,艾姆斯试验测定潜在化学致癌物的基本原理Salmonella typhimurium的组氨酸缺陷型（his）菌株在 平板上不能生长，如发生回复突变则能生长。如将可疑“三致”物黄曲霉毒素，加入鼠肝匀浆，保温一段时间后，吸入滤纸片中，然后将滤纸片放置于平板中央。经培养后，出现三种情况：如在平板上无大量菌落产生，说明试样中不含诱变剂；如在纸片周围有一抑制圈，其外才是大量菌落，说明试样中某诱变剂的浓度很高；如在纸片周围即生长大量菌落，说明诱变剂的浓度合适。 目前，艾
46、姆斯试验法已广泛用于检测食品、饮料、药物核引水等试样中的致癌物。它具有快速（仅3天左右）、准确（检测致癌物的符合率85%）和费用省等优点。,Ames test：对化学诱变剂做检测,菌种：鼠伤寒沙门氏菌 his -； 原理： his -在基本培养基上不长；而发生回复突变则长。,Ames test 方法示意图,4. 菌种筛选,4.1 筛选方案： 实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。 初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。 复筛
47、的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.,可见，设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要。,以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：,4.2 变异菌的一般筛选方法,4.2.1 平皿快速检测法 变色圈法 透明圈法 生长圈法 抑菌圈法 梯度平板法 4.2.2 摇瓶培养法,4.3 特殊变异菌的筛选方法：,以温度敏感突变为例： 筛选方法： 用途：常用于提高代谢物产量 原因：是由于某一酶蛋白结构改变后，在高温下活力丧失 重要性：如果此酶为蛋白质、核酸合成途径中所需的酶，则此变异株在高温下的表型就是营养缺陷型。,4.3.1条件
48、抗性突变型的筛选,举例： 由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌2256，经诱变处理得到温度敏感变异株Ts88: 30培养时能正常生长 40时死亡，但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸（而野生型却受生物素的反馈抑制）。,在富含生物素的培养基中进行发酵时： 先在30（允许条件）中进行培养以得到大量菌细胞，适当时间后提高温度（ 40 ，非允许条件），即能获得谷氨酸的过量生产。,方法：梯度平板法（gradient plate）,4.3.2抗药性突变株的筛选,抗药性突变株的应用： 作为菌株的遗传标记 作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）,4.3.3抗生素抗性变异株的筛选：,与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体： 营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys -， bio- 野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野