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1、遗传学实验 惠州学院生命科学系,实验一 植物细胞有 丝分裂及染色体制片技术,有丝分裂中期的染色体具有典型的形态特征，并容易计数。为了获得更多的中期染色体装片，可以采用常用的药物处理方法，阻止纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期，便于进行观察。,5 软化：将解离好的根尖冲洗后，放入45%醋酸中软化10min左右。,请问解离与软化的目的是什么？,6 染色：切取12mm的分生区，用改良苯酚品红染液染色1020min。,为保证染色的充分要注意哪些问题？,7 压片：盖上盖玻片，在酒精灯上烤片。然后固定盖玻片，用铅笔垂直、用力敲击盖片几下，将材料压成一层细胞。,8 镜检：先在低倍镜下找到细胞，再换成高倍镜仔
2、细观察有丝分裂过程中染色体的行为。,压片时应注意的问题有哪些？,请注意比较经过预处理和未经预处理的材料有何不同？,2 讨论：经过预处理和未经预处理的两个装片的不同，为什么会不同？,实验二 果蝇的生活史及形态观察,一、实验目的与要求,1.了解果蝇生活史各阶段的形态特征，观察果蝇的几种常见的突变类型。 2.掌握辨别雌雄果蝇的方法。 3.了解果蝇的饲养方法和处理方法。,二、实验原理,三、实验材料、用具和药品,1.材料：野生型和常见的突变型果蝇。 2.用具：体视显微镜、放大镜、小镊子、培养瓶、麻醉瓶、白瓷板、培养皿、毛笔。 3. 药品：乙醚、琼脂、玉米粉、蔗糖、酵母粉、苯甲酸。,果蝇形体小，生长迅速，
3、繁殖率高，饲养简便，突变性状多，是遗传学研究的极好材料。,四、实验方法与步骤,1. 果蝇培养基的配制 玉米粉培养基 2.果蝇的生活史观察 3.果蝇的麻醉 乙醚麻醉0.5min后转入培养皿中，如观察中苏醒，可在培养皿内放一个滴有乙醚的滤纸条补救。 4.果蝇的性状观察,五、作业,1.描述果蝇的生活史。 2.如何区别雌雄果蝇？,四、实验方法与步骤,1. 取材 取果蝇三龄幼虫置于载玻片上，滴加0.7生理盐水 2.剖取果蝇唾腺 3.染色压片 4.镜检,五、作业,1. 绘出所观察到的果蝇唾腺染色体的图像，标明染色中心和5条臂。 2. 果蝇唾腺染色体与其他染色体在形态结构上有什么区别？,实验三 果蝇杂交实验
4、,一、实验目的与要求,通过自行设计实验方案，研究果蝇两对相对性状的杂交试验结果分析，验证独立分配规律。,二、实验原理,三、实验材料、用具和药品,1.材料：长翅、黑檀体与残翅、灰体的果蝇。 2.用具：体视显微镜、饲养瓶、麻醉瓶、海棉板、白瓷板、解剖针、镊子、毛笔等。 3. 药品：乙醚、酒精等。,长翅黑檀体的雌蝇与残翅、灰体的雄蝇交配(或反交)，F1代自交而得的F2产生性状分离和重组，出现四种表现型，比例为9:3:3:1。,四、实验方法与步骤,1. 麻醉 2.选取长翅、黑檀体处女蝇和残翅、灰体雄蝇56对(或反交)，一起放入事先装有培养基的饲养瓶内。 3.一周后倒出亲本果蝇，等F1羽化后进行观察、记
5、录。 4.任意选取正交或反交组合的F1雌雄果蝇(雌蝇必须处女蝇)78对，放入一个培养瓶中。 5.一周后倒去F1果蝇，待F2羽化后10天进行观察统计。,五、作业,1.对观察资料进行2测验，讨论实验结果是否符合独立分配规律。 2.果蝇杂交时应注意哪些事项？,实验四 植物多倍体的诱发与鉴定,一、实验目的与要求,1. 掌握人工诱发多倍体植物的原理、方法及其在植物育种上的意义。 2. 观察多倍体植物，鉴别植物染色体数目的变化。,二、实验原理,三、实验材料、用具和药品,1.材料：玉米、水稻或其他植物种子。 2.用具：显微镜、生化培养箱、冰箱、天平、镊子、解剖针、刀片、载玻片、盖玻片、烧杯、量筒、吸水纸。
6、3. 药品：秋水仙素、95%酒精、冰醋酸、盐酸、碘化钾等。,四、实验方法与步骤,1. 秋水仙素溶液配制 2. 材料处理、固定、保存 3. 压片 4. 镜检,五、作业,绘出玉米根尖多倍性细胞的中期染色体图像。,实验五 蚕豆根尖微核检测技术,一、实验目的与要求,1. 了解微核测试原理和毒理遗传学意义 。 2. 学习蚕豆根尖的微核测试技术 。,二、实验原理,三、实验材料、用具和药品,1.材料：蚕豆种子。 2.用具：显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、烧杯等。 3. 药品：卡诺固定液、盐酸酒精解离液、改良苯酚品红染液、NaN3等。,微核是真核生物细胞经各种理化因子作用后引起染色体畸变，在间期细胞中的一种表现
7、形式。,四、实验方法与步骤,1.浸种催芽 2.用被检测液处理根尖 3.根尖细胞恢复 4.根尖细胞固定、酸解、染色 5.显微镜下观察,五、作业,1. 在蚕豆根尖细胞的微核测试中，为什么要进行恢复培养？ 2. 产生微核的根尖细胞在产生前的分裂中期可能出现什么样的中期分裂图像？,实验六 利用ISSR分析植物遗传多样性,一、实验目的 1、掌握ISSR技术的基本原理和操作方法； 2、掌握植物遗传多样性分析方法。 二、实验原理 ISSR分子标记是在SSR标记基础上发展起来的一种新技术，其基本原理是在SSR的5或3端加锚14个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行
8、扩增。重复序列和锚定碱基是随机选择的，扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，每个引物可以产生比RAPD方法更多的扩增片段，因此，ISSR标记是一种快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的DNA指纹技术。,三、实验材料 水稻或其他植物不同品种或品系。 四、操作步骤：（以水稻为例）。 1准备材料，10-15个水稻品种的种子。 2、种子发芽，提取玉米总DNA（具体操作参见附1）。 3、检测DNA的纯度（具体操作参见附2）。 4、应用ISSR引物扩增玉米DNA（具体操作参见附3）。 5、应用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物（具体操作参见附4）。 6、分析实验结果。,五、注意事项 1、本实验涉及内容较多
9、，请大家认真阅读有关资料，掌握实验原理。 2、本实验所用的一些试剂具有一定的毒性，请大家注意安全。 3、本实验所用时间较长，部分实验内容同学可以另外安排实验进行。,六、作业及思考题 1、应用ISSR技术分析植物品种遗传多样性应注意哪些因素？ 2、分析植物品种遗传多样性在遗传学研究上有什么作用？,附1植物基因组DNA的提取,一、实验目的与要求,掌握从高等真核生物细胞中制备基因组DNA的基本原理，熟悉从高等植物中提取基因组DNA的技术流程。,二、实验原理,三、实验材料、用具和药品,1.材料：幼嫩的水稻幼苗。 2.用具：水浴锅、液氮罐、离心机、移液枪、电泳设备、凝胶成像分析系统、研钵等。 3. 药品
10、：2CTAB抽提缓冲液、氯仿异戊醇（241）、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇、TE等。,采用CTAB法提取植物DNA,四、实验方法与步骤,1.样品加液氮研磨成粉末，加2CTAB抽提缓冲液65水浴保温30 min以上； 2.加入等体积的氯仿异戊醇（241）； 3. 12000 rpm，室温，离心1020 min； 4.将上清液加入2/3体积的经-20预冷的异丙醇； 5.将DNA沉淀用70%乙醇洗涤； 6.干燥后的DNA沉淀溶于适量TE（pH8.0）缓冲液中； 7.取少量DNA溶液在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离并在凝胶成像分析系统上观察。,五、作业,分析电泳结果，解释原因。,附2 DNA浓度的测定
11、,一、实验材料 所提取的水稻DNA母液。 二、实验器具和药品 1用具：7522紫外分光光度计、取样器 2药品：双蒸馏水、TE 三、操作步骤 1讲解和练习分光光度计的使用方法 2取20ml提取的核DNA，加入1980ml蒸馏水对待测DNA样品做1:100(或更高倍数的稀释);,3蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。 4加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50mg /ml双链DNA，33mg /ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）
12、估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。,5记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下: dsDNA（mg /ml）=50(OD260) 稀释倍数,附3 聚合酶链式反应（PCR）实验,一、基本原理 双链DNA分子经高温变性后成为两条单链DNA（模板DNA），单链DNA在互补寡聚核苷酸片段（引物）的引导下，可以利用DNA多聚酶按5 3方向复制出互补DNA。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）的原理类似于DNA的天然复制过程。在缓冲液中有引物、DNA合成底物dNTP存在下，经变性、退火和延伸即可合成产物DNA。
13、经若干个这样的循环后，DNA即可扩增2n倍。具体过程如下：,1、变性：加热使模板DNA在高温（94oC）下变性，双链中的氢键断裂而形成两条单链。 2、退火：使溶液温度逐渐降至50-60 oC，模板DNA即可与引物按碱基配对原则互补结合。 3、延伸：再将溶液反应温度升至72 oC，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷酸（dNTP），按5 3方向复制出互补DNA。 上述三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量即可增加一倍，新形成的链又可成为下一轮循环的模板，经过25-30个循环后，DNA可扩增106-109倍。,二、实验器材 PCR热循环仪、琼脂
14、糖凝胶电泳系统、加样枪、枪头、离心管。 三、材料与试剂 1）DNA模板：0.1ug/ul水稻DNA，使用前用TE缓冲液或ddH2O稀释10倍置于冰中。 2）4种脱氧核苷酸（dNTP）：4倍dNTP，即1mmol/L dNTP 、1mmol/L dATP 、1mmol/L dCTP 、1mmol/L dGTP 、1mmol/L dTTP 。 3） 50nmol/L 引物： ISSR第808号引物：AGAGAGAGAGAGAGAGC ISSR第812号引物：GAGAGAGAGAGAGAGAA,4）2.5U/ul Taq聚合酶 5）DNA 标记（Marker） 6）10X PCR反应缓冲液：含有50
15、0mmol/L KCl、100mmol/L HCl(PH9.0)、15mmol/L Mg2Cl、0.1%(W/V)明胶、1%Triton X-100。 7 ） DNA琼脂糖凝胶电泳全部试剂,四、操作步骤 1）0.5ml Eppendorf管一个，反应总体积20ul,用加样枪按以下顺序分别加入各种试剂： 反应物 体积（ul） ddH2O 14.3 10X buffer 2 Mg2+ 1.5 dNTP 1 primer 0.5 Taq 0.2 DNA模板 0.5,附4 琼脂糖凝胶电泳检测植物DNA实验,一、实验原理 琼脂糖凝胶电泳法（agarose gel electrophoresis）主要用于
16、分离、鉴定和纯化DNA片段。用溴化乙锭(ethidium bromide,简称EB，诱变致癌物质！)染色，在紫外灯下，凝胶中1ng的DNA即能直接观察到。琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依赖它们的分子量及分子构型。凝胶类型及其浓度对被分离核酸的分子大小的关系重大。,二、实验器材和试剂的配制 1、实验器材：恒压恒流电泳仪、水平板电泳槽、移液器、烧杯、容量瓶、三角瓶、电炉。 2、试剂的配制： 1）电泳缓冲液（10XTBE溶液）：108g Tris，55g硼酸，7.44g EDTA，加双蒸水定容至1000ml，PH8.5，用时稀释10倍。 2）载样缓冲液：溴酚蓝250mg,加双蒸水10ml ，室温
17、下过夜；二甲苯腈蓝250mg，加双蒸水10ml 溶解；蔗糖40g，加双蒸水溶解；合并三溶液，加双蒸水定容至100ml。,三、实验步骤 1、制agarose凝胶：称0.3g agarose，倒入250ml三角瓶中，加1X TBE溶液50ml，水浴加热溶解。冷却至60oC，用移液器加入2ul EB溶液，晃动使混匀。将制胶板两端密封，放上梳子，倒胶，3060min胶凝固后，拔去梳子。 1）上样：将胶板两端的挡板或胶布移去，把胶板置于电泳槽中，注入1X TBE缓冲液，使电泳缓冲液液面高出胶平面1cm左右。移取载样缓冲液15ul,DNA提取液2ul，混匀后将样品液加入梳孔中。在两端或中央梳孔上加入DNA
18、 ladder标记。,2）电泳：接通电泳仪，上样品端接负极。调节电压电流，电压5-10V/cm，电流1050mA。恒压电泳2小时左右。 3）检测：关闭电泳仪，将电泳后的凝胶置于紫外分析仪上观测。DNA被溴化乙锭染色后在紫外光下呈现金黄色荧光，照相后关闭电源（紫外线对人眼有害，不要久看）。,2) PCR扩增程序，总时间约4小时 94 OC预变性5min后进入循环 94 OC变性30S 52 OC复性45S 72 OC延伸1min Go to ,34 cycle 72 OC延伸8min 12 OC Forever End 3) 琼脂糖凝胶电泳,分析PCR结果。,实验七人类X小体检测,一、实验目的
19、掌握X小体的玻片标片制作方法，绘制X小体形态特征及所在部位。鉴定个体的性别，为进一步研究人类染色体畸变与疾病的关系提供基础方法、为遗传病临床诊断提供参考。,二、实验原理 1949年Barr和Bertran在研究猫的间期神经细胞时，发现雌猫体细胞核膜边缘有一个可被碱性染料染色的小体而雄猫没有。后来发现人类正常女性口腔上皮、阴道上皮、皮肤、羊水等的细胞中都有一个这样的小体，继而有人进一步发现所有哺乳动物雌体细胞中都有同样的一个小体。,一般认为这种小体是两个X染色体中的一个在间期发生异固缩形成的，故而将其称为X小体，X染色质，又称为Barr小体。Barr小体出现在哺乳动物雌性个体细胞的细胞核膜边缘，
20、这主要是因为这条染色体处在失活状态所致，Morishima等利用放射性标记的方法证实了失活状态的性染色体与其他异染色质（heterochromatin）一样，在DNA复制时总落后于其他常染色质，且大多出现在核膜边缘。性染色质的数目是X染色体数减1。故可以根据X小体的有无、数目来鉴定胎儿的性别和性别畸形。,Y小体是人类男性体细胞中Y染色体长臂末端显现的明亮小体，是由萤光染料染色后显示的萤光所致。因而称为Y小体或Y染色质。亦可根据Y小体的有无、数目鉴定胎儿的性别和性别畸形,三、实验材料 口腔粘膜（男女）、发根细胞（女）。,四、实验器具和药品 1.器具：普通显微镜、荧光显微镜、恒温水浴锅、载玻片、盖
21、玻片、镊子、牙签、滤纸、纱布等。 2.药品：95%乙醇、乙醚、改良碱性品红、盐酸喹吖、Macllvaine氏缓冲液、石蜡。,五、实验步骤 取材:受检查者用水漱口数次，尽可能除去细菌和食物残渣；用洁净的牙签从口腔两侧颊部刮取粘膜，第一次刮取物弃去，将第二次、第三次刮取物涂在干净的载玻片上。 固定:滴加固定液（95%乙醇:乙醚=1:1或直接用乙醇）固定2030min，空气干燥。 染色制片:滴加12滴改良品红于室温下染色1020min（勿使干燥），加上盖片，垫上滤纸用手指轻轻加压即可。,镜检：低倍镜下计数100个核膜完整，细胞不重叠，无核固缩的细胞；并在高倍或油镜下观察。 若使用女性发根细胞，需选用
22、带有毛囊的头发（约2cm长），再加一滴染液后加上盖玻片，洒精灯上微热，静置5min，后盖一滤纸压片。,人口腔X小体,六、实验结果 1.X小体： 油镜下可见X小体为一致密的浓染小体。轮廓清晰，约1um，常附着于核膜边缘或靠边内侧，其形态有三角形、卵形、扁平形等。 正常女性间期细胞核中X小体比例约30%50%，男性中则偶尔可见（2%），且不典型。,七、作业及思考题 1.统计X小体的频率，画23个典型细胞，示X小体的形态和所处部位。 2.什么是剂量补偿效应？ 3.Barr小体分析技术在人类遗传学工作中有什么用途？ 4.在制片过程中使用HCl酸解的目的是什么？ 5.为什么Barr小体一般出现在核膜边缘
23、？,实验八 遗传平衡定律,一、实验目的 通过实验进一步理解Hardy-Weinberg 定律的原理；调查周围人群中ABO血型系统的基因频率和基因型频率的情况；以果蝇为模式生物，人工模拟选择对基因频率和基因型频率改变的影响。,二、实验原理 Hardy-Weinberg定律是群体遗传学中的基本定律，又称为遗传平衡定律。它的基本含义是指在一个大的附机交配的群体中，在无突变、无任何形式的选择、无迁入迁出、无遗传漂变的情况下，群体中的基因频率和基因型频率可以世代相传不发生变化，并且基因型频率是由基因频率决定的。它推导过程包括3个主要步骤：1）从亲本到其产生的配子；2）从配子结合到产生基因型；3）从合子基
24、因型到子代的基因频率。P2+2pq+q2=1 是一对等位基因的情况下的遗传平衡公式。,三、实验用具及材料 普通果蝇及残翅突变型果蝇、双筒解剖镜、麻醉瓶、毛笔、白板纸、乙醚、玉米粉、糖、酵母粉、琼脂等。,四、实验方法及步骤 1、周围人群中ABO血型系统的基因频率和基因型频率的调查 对周围人群的ABO血型的不同表现进行统计，进而估算出基因频率。,设p=IA的频率，q=IB的频率，r=I的频率，当群体处于平衡时 则p+q+r=1 p2+q2+r2+2pq+2pr+2qr=1 又设A、B、AB、O为各血型的表现型频率 则A= p2+2pr B= q2+2qr AB=2pq O= r2 根据遗传平衡公式
25、计算出各基因频率，并检验此群体是否处于平衡状态。,2、人工模拟选择对果蝇正常翅、残翅等位基因的基因频率的影响 （1）选用两个纯合的果蝇群体，即正常翅和残翅类型。分别从2个群体中选取雌处女蝇和雄蝇各20只，共同放入一个大的培养瓶中，放入25培养箱中培养。记录亲本正常走翅和残翅的只数。并计算此时群体中正常翅和残翅基因的频率。,（2）当发现培养瓶内有幼虫或蛹出现时及时将亲本处死，以防发生回交。当有F1个体出出后，观察其表型，记录F1正常翅和残翅的只数。 （3）将F1群体中出现的残翅个体全部处死。在一个新的培养瓶中分别放入20只正常翅雌果蝇和雄果蝇继续培养。即F1F1，此时不需要选处女蝇。培养至有F2代产生。记录F2正常翅和残翅的只数。,（4）将F2群体中出现的残翅个体合部处死，在一个新的培养瓶中分别放入20只正常翅雌果蝇和雄果蝇继续培养，配成F2F2。记录F3中正常雌和残翅的只数。 （5）进行与（4）同样的实验步骤，直至记录到F4，F5。,（6）计算基因频率和基因型频率，将数据填入表中。,五、作业及思考题 （1）实验一中的数据是否满足平衡公式？为什么？ （2）实验二的设计思路是怎样的，模拟了怎样的选择影响？结果怎样？ （3）实验二设计上有什么样的缺陷，如何弥补？应如何改进？ （4）通过以上两个实验，你从中学到什么知识？,