第5章-代谢总论与生物氧化.ppt

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1、第5章 代谢总论和生物氧化,生物化学课件,第一节 新陈代谢总论,一、 新陈代谢的概念,新陈代谢,合成代谢 （同化作用）,分解代谢 （异化作用）,生物小分子合成为 生物大分子,需要能量,释放能量,生物大分子分解为 生物小分子,能量代谢,物质代谢,新陈代谢的共同特点：,1. 由酶催化，反应条件温和。,2. 诸多反应有严格的顺序，彼此协调。,3. 对周围环境高度适应。,二、 新陈代谢的研究方法,1. 活体内(in vivo)与活体外实验(in vitro),2. 同位素示踪法,3. 代谢途径阻断法,4. 遗传缺欠症及动物模型等方法,三、 生物体内能量代谢的基本规律,自由能：生物体（或恒温恒压）用以作

2、功的能量。在没有作功条件时，自由能转变为热能丧失。,G = H - TS,对于 A + B C + D,G= - 2.303 RT lgK K = CD / AB,四、 高能化合物与ATP的作用,高能化合物,磷酸化合物,非磷酸化合物,磷氧型,磷氮型,硫酯键化合物,甲硫键化合物,烯醇磷酸化合物,酰基磷酸化合物,焦磷酸化合物,一般将在生物体内水解某物质1mol时，能释放超过21 kJ /mol（5kCal/mol)以上自由能（G -21 kJ / mol）的化合物称为高能化合物。,生物体内只有这些物质才能直接将能量传递给ATP,（1）烯醇式磷酸化合物(例),磷氧型高能磷酸化合物：,- 61.9 k

3、J/mol,(2)酰基磷酸化合物（例）,- 42.3 kJ/mol,（3）焦磷酸化合物（例）,磷氮型高能磷酸化合物：,- 43.1 kJ/mol,(1) 硫酯键型高能化合物 （例）,非磷酸高能化合物：,乙酰辅酶A 31.4 kJ/mol,(2) 甲硫型高能化合物 （例）, 41.8 kJ/mol,O,N,N,N,N,NH2,-H,H-,OH,H,O - O-P O - O,O O -P O-P-O-CH2 - O - O,OH,ATP的特殊作用,作用：是能量的携带者或传递者，而非贮存者，是能量货币,ATP是生物细胞内能量代谢的偶联剂,ATP H2O ADP Pi 其G0= - 30.51kJm

4、o1； 当ADP Pi ATP时， 也需吸收30.51kJmol的自由能,第二节 生物氧化,有机物质在细胞内的氧化作用。又称组织呼吸或细胞呼吸。 在整个生物氧化过程中，有机物质最终被氧化成CO2和H2O，并释放出能量形成ATP。,一、 生物氧化的特点,（一）氧化还原的本质电子转移 电子转移的主要形式： 1. 直接的电子转移 Fe2+ + Cu2+ Fe3+ + Cu+,1. 在细胞内，于体温、近于中性的含水环境中由酶催化。,2. 能量逐步释放，部分存于ATP中。,3. 分为线粒体氧化体系和非线粒体氧化体系。,2. 氢原子的转移 AH2 + B A + BH2 ( H H+ + e ) 3. 有

5、机还原剂直接加氧 RH + O2 + 2H+ + 2e ROH + H2O,（二）生物氧化的特点,(1) 直接脱羧,(2)氧化脱羧,：在脱羧过程中伴随着氧化（脱氢）,生物体内CO2的生成来源于有机物转变为含羧基化合物的脱羧作用。,二、 生物氧化中CO2的生成,三、生物氧化中 H2O 的生成,生物氧化作用主要是通过脱氢反应来实现的。 代谢物脱下的氢经生物氧化作用和吸入的氧结合生成水。,在生物氧化中，碳的氧化和氢的氧化是非同步进行的。,生物体主要以脱氢酶、传递体及氧化酶组成生物氧化体系，以促进水的生成。,HOOCCH2CHOHCOOH,NADP+,NADPH + H+,O,苹果酸,CH3CCOOH

6、 + CO2,1、概念 代谢物上的氢原子被脱氢酶激活脱落后，经一系列传递体，最后（将质子和电子）传递给氧而生成水的全部体系，称呼吸链(respiratory chain)。此体系也称电子传递体系或电子传递链(electron transfer chain)。 由于参与这一系列催化作用的酶和辅酶及中间传递体在膜（原核细胞膜、真核线粒体内膜）上一个接一个地构成了链状反应，故常将这种形式的氧化过程称为呼吸链。,（一）呼吸链,ATP合成酶,2、呼吸链种类 根据代谢物上脱下的氢的初始受体不同，在具有线粒体的生物中，典型的呼吸链有2种： NADH呼吸链：绝大部分分解代谢的脱氢 氧化反应通过此呼吸链完成 F

7、ADH2呼吸链：只能催化某些代谢物脱 氢，不能使NADH或NADPH脱氢,在电子传递过程中释放出大量的自由能，使ADP磷酸化生成ATP，这是生物合成ATP的基本途径之一。 实际上，生物体中能量获得的本质正是氢的氧化。,3、呼吸链的组成,（1）烟（尼克）酰胺脱氢酶类以NAD+或NADP+为辅酶的脱氢酶，已知的有200多种 该类酶均为不需氧脱氢酶，即不以氧为直接受氢体。在这类酶的作用下，代谢物脱下的氢被其辅酶接受而转变为NADH或NADPH；当有受H体存在时， NADH或NADPH上的H可被脱下而氧化为NAD+或NADP+。所以它既是一种脱氢酶，也是一种还原酶。,（2） 黄素脱氢酶类以FMN或FA

8、D为辅基的脱氢酶类 该类酶也属不需氧脱氢酶，催化代谢物脱下一对H原子，使FMN或FAD还原为FMNH2或FADH2。 FMN和FAD是比NAD+或NADP+ 更强的氧化剂。,FMNH2或FADH2可进一步将电子转移给辅酶Q。,(3)铁硫蛋白类（简写为Fe-S ） 铁硫蛋白(Fe-S)是一类与电子传递有关的非血红素铁蛋白，其作用是借铁的化合价互变进行电子传递: Fe3+ + e Fe2+ 因铁硫蛋白的活性部分含有活泼的硫和铁原子，故称铁硫中心。 铁硫蛋白在生物界广泛存在。在线粒体内膜上常与黄素酶或细胞色素结合成复合物而存在。在从NADH到氧的呼吸链中，有多个不同的铁硫中心，有的在NADH脱氢酶中

9、，有的与细胞色素 b及c1有关。,铁硫蛋白有几种不同的类型，可概括为3类：, FeS , 2Fe 2S , 4Fe 4S ,（4）辅酶Q类,是电子传递链中唯一的非蛋白电子载体。为一种脂溶性醌类化合物，又名泛醌，简写为CoQ或Q。,CoQ分子中的苯醌结构能可逆地加氢还原而形成对苯二酚衍生物，故属于递氢体。但它不能从底物接受氢，而是一种中间传递体。,CoQ也是呼吸链中唯一一个和蛋白质结合不紧的传递体（辅酶），这使它在黄素蛋白类和细胞色素类之间能够作为一种特殊灵活的电子载体起作用。,（5）细胞色素类一类含有血红素辅基的电子传递蛋白的总称,细胞色素主要是通过Fe3+ + e Fe2+ 的互变起传递电子

10、的作用。 线粒体电子传递链至少含有5种细胞色素：a 、a3 、b、c、c1。 各种细胞色素的辅基结构略有不同。 a a3 、b、c1中卟啉Fe与蛋白质非共价结合， c 的辅基与蛋白质以硫醚键共价结合。 典型的线粒体呼吸链中，细胞色素的顺序是：b c1 c aa3 O2。,Cyt a和a3组成一个复合体，二者无法分开，除了含有铁卟啉外，还含有铜原子。Cyt a a3可以直接以O2为电子受体，所以a a3又称细胞色素c氧化酶。 a与a3之间的两个铜离子，起电子传递作用：发生Cu+ Cu2+ 的互变，将Cyt c所携带的电子传递给O2。,b、 c1 、 c、a 卟啉Fe与环及蛋白形成6个配位键：4个

11、与Fe，1个与His，1个与蛋白链中Met形成。 a3卟啉Fe与环及蛋白形成5个配位键（不与Met形成）, 空一个配位键与O2，CO，CN等结合，其正常功能是与O2结合。,细胞色素的附基,NADH呼吸链顺序： NADH-FMN-CoQ-Cytb-c1-c-aa3- 1/2O2 FADH2呼吸链顺序： FADH2 -CoQ-Cytb-c1-c-aa3- 1/2O2或 琥珀酸-FAD -CoQ-Cytb-c1-c-aa3- 1/2O2,4. 呼吸链中传递体的顺序,鱼藤酮 安密妥,抑制剂：,抗霉素A,氰化物，CO, 叠氮化合物,a. 测定各电子传递体氧化还原电位的数值按氧化还原电位由低到高顺序排列；

12、 b. 利用电子传递抑制剂确定其顺序；,（1）确定呼吸链中各传递体顺序的方法依据：,电子传递抑制剂:能够阻断呼吸链中某一部位电子传递的物质。,各组分E ： 低 高 电子迁移方向：低电位 高电位, G：逐步降低 放能,d. 根据从线粒体中分离到的传递体复合物 (4种)。,c. 通过电子传递体体外重组实验加以验证；,1）NADH泛醌还原酶,简写为NADHQ还原酶, 即复合物I，其作用是催化NADH的氧化脱氢以及Q的还原。所以它既是一种脱氢酶，也是一种还原酶。 NADH + Q + H+ NAD+ + QH2 NADH所携带的高能电子是线粒体呼吸链主要电子供体之一。 NADHQ还原酶是线粒体内膜上最

13、大的一个蛋白质复合物。最少含有34条多肽链，分别由核和线粒体两个基因组编码。它的活性部分含有辅基FMN和铁硫中心。 FMN的作用是接受脱氢酶脱下的电子和质子，形成还原型FMNH2。还原型FMNH2可通过铁硫中心进一步将电子转移给Q。,NADHQ还原酶,2）琥珀酸-Q还原酶（琥珀酸脱氢酶）,琥珀酸是生物代谢过程（三羧酸循环）中产生的中间产物，它在琥珀酸-Q还原酶（复合物II）催化下，将两个高能电子传递给Q。再通过QH2-Cyt c还原酶、Cyt c和Cyt c氧化酶将电子传递到O2。 琥珀酸-Q还原酶也是存在于线粒体内膜上的蛋白复合物, 比NADH-Q还原酶的结构简单，由4个不同的多肽亚基组成。

14、其活性部分含有辅基FAD和铁硫蛋白。 琥珀酸-Q还原酶的作用是催化琥珀酸的脱氢氧化和Q的还原。,CoQH2,复合物,复合物 ,2e,2H+,3）泛醌细胞色素c还原酶,简写为QH2-Cyt c还原酶, 即复合物III, 它是线粒体内膜上的一种跨膜蛋白复合物，其作用是催化还原型QH2的氧化和细胞色素c（Cyt c）的还原。 QH2-Cyt c 还原酶 QH2 + 2 Cyt c (Fe3+) Q + 2 Cyt c (Fe2+) + 2H+ QH2-Cyt c还原酶由9个多肽亚基组成，活性部分主要包括细胞色素b 和c1，以及铁硫蛋白（2Fe-2S）。,Cyt b,bL(562), bH(566),

15、4）细胞色素c氧化酶,简写为Cyt c 氧化酶，即复合物 IV，它是位于线粒体呼吸链末端的蛋白复合物，由12个多肽亚基组成。活性部分主要包括Cyt a和a3，两者组成一个复合体，除了含有铁卟啉外，还含有铜原子。Cyt a a3可以直接以O2为电子受体。 Fe2+ + Cu2+ Cu+ + Fe3+ 2Cu+ + 1/2O2 2Cu2+ + O2- 在电子传递过程中，分子中的铜离子可以发生Cu+ Cu2+ 的互变，将Cyt c所携带的电子传递给O2。,复合物 + 2H+,Cyt c,FADH2,组成： Fo亚基 + F1亚基 Fo ： 寡霉素敏感蛋白（oscp），镶嵌在线粒体内膜中的质子通道 F

16、1：（33）催化生成ATP,ATP合成酶,四、氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation)作用,伴随着放能的氧化作用而进行的ATP合成。,ADP + Pi + 能量 ATP,AMP + PPi + 能量 ATP,（一） ATP的生成,1. 底物水平磷酸化,氧化磷酸化,底物水平磷酸化,电子传递体系磷酸化,底物被氧化时伴随着分子内部能量的重新分布，形成了某些高能磷酸化合物的中间产物，通过酶的作用使磷酸基团转移到ADP上形成ATP的作用。,底物水平磷酸化反应举例,X + ADP ATP + X,P,2. 电子传递体系磷酸化,当电子从NADH或FADH2经过电子传递体系（呼吸链）传

17、递给氧形成水时，同时伴有ADP磷酸化为ATP，这一全过程称为电子传递体系磷酸化。,底物水平磷酸化是捕获能量的一种方式，在发酵作用（无氧呼吸）中是进行生物氧化取得能量的唯一方式。 底物水平磷酸化和氧的存在与否无关，在ATP 生成中没有氧分子参与，也不经过电子传递链传递电子。,（1）概念,1,ATP合成酶,（2） P/O比和由ADP生成ATP的数目,电子传递体系磷酸化是需氧生物获得ATP 的一种主要方式，是生物体内能量转移的主要环节，需要氧分子的参与。真核生物氧化磷酸化过程在线粒体内膜进行，原核生物在细胞质膜上进行。,P/O比： 是指物质氧化时，每消耗1摩尔氧原子所消耗的无机磷酸的摩尔数（或ADP

18、摩尔数），即生成ATP的摩尔数。 NADH呼吸链：P/O比值接近3， FADH2呼吸链：P/O比值接近2， 故推断从NADH到分子氧、FADH2到分子氧的呼吸链上释放的能量，可分别用于3个、2个ATP。,（3）呼吸链电子传递过程中的自由能变化,1,复合物I: NADHCoQ, E0= 0.360V，G0= -69.5kJ/mol 复合物III: CoQ Cytc, E0= 0.190V， G0= -36.7kJ/mol 复合物IV: Cytaa3 O2, E0= 0.580V， G0= -112kJ/mol 复合物II:（FAD与酶结合后E升高到0-0.03） FADH2 CoQ, E0= 0

19、.085V，G0= -16.4kJ/mol,可见，当一对电子相继经过复合物、和时，每一步都释放出足以合成一分子ATP的自由能，即泵出4个H+的能量； 但当一对电子经过复合物时，释放的能量不足以合成ATP，其作用仅仅是将电子由FADH2注入电子传递链。,最近的研究表明：复合物、和不能直接合成ATP，但能螯合通过电子传递所产生的自由能，从而将质子由线粒体基质泵出至膜间隙，形成跨膜的质子梯度。 跨膜质子梯度所蕴含的自由能是推动ATP合成的驱动力。,跨膜质子转移,（二）胞液中 NADH 的氧化磷酸化,在细胞质中经糖酵解产生的 NADH，不能透过线粒体内膜进入呼吸链以便进行有氧氧化。只能通过两种精妙的“

20、穿梭”系统解决 NADH 的再氧化问题。一种称为甘油-磷酸穿梭系统，另一种称为苹果酸-天冬氨酸穿梭系统。,NADH + H+,线粒体内膜,甘油-磷酸穿梭作用,甘油-磷酸,FAD,二羟丙酮磷酸,FADH2,NADHFMNCoQbc1caa3O2,胞液甘油-磷酸脱氢酶；,线粒体甘油-磷酸脱氢酶(黄素蛋白脱氢酶),肌肉和神经组织中,细胞浆,酵解,NADH,草酰乙酸,天冬氨酸,NAD+,苹果酸,苹果酸,NAD+,草酰乙酸,NADH,天冬氨酸,NADH呼吸链,苹果酸-天冬氨酸穿梭系统,转氨酶,转氨酶,细胞质,线粒体,细胞质苹果酸脱氢酶,线粒体苹果酸脱氢酶,线粒体内膜,心、肝、肾,化学偶联假说,构象偶联假

21、说,化学渗透假说,1. 化学偶联假说,1953年Edward Slater 最先提出。认为电子传递产生一种高能共价中间物，它随后的裂解释放能量驱动ATP合成。但在电子传递体系磷酸化作用中一直未找到任何一种活泼的高能中间物。,（三）氧化磷酸化作用机制,氧化作用（电子传递）与磷酸化作用相偶联已经不存在任何疑问，但对二者究竟如何偶联，尚有许多未完全阐明的问题。共存在三种假说：,2. 构象偶联假说 1964年Paul Boyer最先提出。认为电子沿呼吸链传递使线粒体内膜蛋白质组分发生构象变化，而形成一种高能形式，这种高能形式通过将能量提供给ATP合成而恢复其原来的构象。但至今未能找到有力的实验证据。

22、3. 化学渗透假说（chemiosmotic hypothesis） 1961年英国生物化学家Peter Mitchell首先提出，1978年获诺贝尔化学奖。 基本要点：电子经呼吸链传递时释放出的自由能，可将质子（H+）从线粒体内膜的基质侧泵到内膜外侧，产生膜内外质子电化学梯度（H+浓度梯度和跨膜电位差），以此储存能量。当质子顺浓度梯度回流时驱动ADP与Pi生成ATP。,化学渗透假说要点分述： 1. 呼吸链中递氢体和电子传递体在线粒体内膜中是间隔交替排列的，并且都有特定的位置，催化反应是定向的。 2. 递氢体有氢泵的作用, 可将其中的电子（2e）传给位于其后的电子传递体,而将H+ 质子从内膜泵

23、出到膜外侧。在电子传递过程中,每传递一对电子就泵出10H+ 质子。?,氧化磷酸化作用的关键因素是质子（H+）梯度和完整的线粒体内膜。,3. 内膜对H+ 不能自由通过，泵出膜的外侧H+ 不能自由返回膜内侧，因而使线粒体内膜外侧的H+ 浓度高于内侧，造成H+浓度的跨膜梯度，此H+ 浓度差使外侧的pH 较内侧的pH 低1.0 单位左右，并使原有的外正内负的跨膜电位增高，此电位差中就包含着电子传递过程中所释放的能量，好象电池两极的离子浓度差造成电位差含有电能一样。这种H+ 质子梯度和电位梯度就是质子返回内膜的一种动力。,G = 2.3 RT pH + Z F , pH = pH(内) pH(外) ,

24、Z 是质子电荷(包括符号)，F是法拉第常数， 是膜电位差,4. 利用线粒体内膜上的ATP 合成酶的特点，将膜外侧的2H+ 转化成膜内侧的2H+，与氧生成水，即H+ 通过ATP 酶的特殊途径，返回到基质，使质子发生回流。由于H+ 浓度梯度所释放的自由能，偶联ADP 与无机磷酸合成ATP，质子的电化学梯度也随之消失。,由上述分析可以看出， Mitchell的理论认为：电子传递释放的自由能和ATP合成是与一种跨线粒体内膜的质子梯度相偶联的。,生理物质的氧化在多个位点（复合物、和 ）为跨膜质子梯度做贡献，而该梯度只在一个部位即FoF1-ATP酶处消减(合成ATP)。,根据最新的进展情况，从呼吸链中电子

25、传递的过程可以看出： 每对电子通过复合物、和可导致10个（442）质子从基质泵出； 来自复合物中的FADH2的电子绕过复合物进入电子传递链只能导致6个（42）质子跨膜移动。 大多数实验测量表明：每合成1分子ATP大约需要3个质子通过FoF1-ATP酶；同时，从细胞质转运合成ATP所需的Pi至线粒体基质要消耗1个质子。故每合成1个ATP需消耗4个质子。 因此，1对H(即2e)经NADH呼吸链生成2.5个ATP，经FADH2呼吸链生成1.5个ATP。,ATP酶的结合改变模型,The binding-change Model proposed by Paul Boyer,1、F1复合物由3个与腺苷结

26、合能力不等的位点，亚基对， 2、在某一时刻，3个亚基一个ATP结合构象（紧密结合） -ATP ，一个与ADP Pi结合构象-ADP（ATP松散结合），一个是ATP释放态构象-empty（空的）； 3、在质子流的推动下， F1复合物中轴（）旋转，（图中箭头方向），连续与亚基对接触，导致-ATP构象改变为-empty ，ATP释放， -ADP构象改变为-ATP，-empty构象改变为-ADP后结合从基质中进入的ADP Pi,用荧光显微镜观察和c亚基的旋转试验,分子马达,（四）氧化磷酸化解偶联 1. 解偶联作用：只抑制ATP 的形成过程，不抑制电子传递过程，使电子传递产生的自由能都变为热能。,2.

27、解偶联剂 ：引起解偶联作用的物质称为解偶联剂，如2.4-二硝基苯酚，双羟香豆素、碳酰氰三氟甲氧苯腙等。 3. 作用机制： 2.4-二硝基苯酚破坏跨膜电位,2,4-二硝基苯酚（2,4-dinitrophenol，DNP）是最早发现的也是最典型的化学解偶联剂。它是一种亲脂性弱酸，在不同的pH 环境中可释放H+或结合H+：在pH 7.0 的环境中，DNP 以解离形式存在，不能透过线粒体膜；在酸性环境中，解离的DNP 质子化，变为脂溶性的非解离形式，能透过膜的磷脂双分子层，同时把一个质子从膜外侧带入到膜内侧，因而破坏电子传递形成的跨膜质子梯度，使氧化磷酸化与电子传递解偶联，抑制ATP 的形成。,生物的

28、一切活动都需要能量。能量来自体内有机物的氧化作用生物氧化。 生物能学的基础概念，符合自然界中普遍的运动规律，即能量守恒与转化定律。物质中储存能量的释放主要通过代谢物脱下2H，经呼吸链中多种酶和辅酶逐步传递最终与O2结合生成H2O完成的。 体内存在两条典型的呼吸链：NADH呼吸链和FADH2呼吸链。,提 要,从线粒体内膜的呼吸链可分离得到四种功能复合物： NADHQ还原酶（I）、琥珀酸-Q还原酶（II）、 QH2-Cyt c还原酶（III)、 Cyt c 氧化酶（ IV）。CoQ和Cyt c不包含在这些复合物中。 呼吸链电子传递过程中释放的能量，大约有40可使ADP磷酸化生成ATP，此过程称为氧化磷酸化偶联。电子传递体系磷酸化是生物获得ATP 的一种主要方式，代谢物脱下一对H（2e）经NADH呼吸链生成2.5个ATP，经FADH2呼吸链生成1.5个ATP。 化学渗透假说是解释氧化磷酸化机制的主要学说。该假说认为，电子经呼吸链传递释放的能量，可将H+从线粒体内膜的基质侧泵到内膜外侧，产生质子电化学梯度储存能量。当质子梯度经ATP合酶通道回流时，驱动ADP磷酸化生成ATP。实验证实，复合物、和均有质子泵的作用。,