第二章基因工程.ppt

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1、第二章 基因工程,一、绪论 1、什么是基因？如何分类？什么是基因表达？ 2、什么是基因工程？它产生的背景是什么？它的理论及意义是什么？,1、什么是基因？如何分类？ 什么是基因表达？,（1）、不少教科书给基因下的定义是：基因是脱氧核糖核酸（DNA）分子上的一个特定的片段。 基因：是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列（或核酸片段），它是控制生物性状的功能和结构单位。 （2）、根据是否转录和翻译功能可分三类： 一类是既有转录功能又有翻译功能的基因，这类基因是指编码酶和结构蛋白质的结构基因及编码阻 蛋白的调节基因（统称为蛋白质基因）；这也是人类基因组计划中所的功能基因（2638339114个）。,第二类

2、是只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括编码tRNA和rRNA的基因； 第三类是既不转录也不翻译的基因，包括启动基因、操纵基因、增强子等（有时也把它称为调控基因）。 （3）、所以基因表达不能说就是遗传信息经转录和翻译从（DNA）传蛋白质的过程。 基因表达：是基因表现其生物功能所经历的一系列分子转化和相互作用的过程。,2、什么是基因工程？它产生的背景是什么？它的理论及意义是什么？,（1）、基因工程：应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物的遗传性，创造新生物物种，通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术。 遗传工程：是包括基因工程在内的人工改造生物遗传性的全部技术； DNA重组技

3、术：是采用酶法，将不同来源 DNA进行体外切割与连接构成杂种DNA分子： 分子克隆：主要是指DNA分子在宿主细胞内的复制过程。三者之间有关系。但是有不同。,（2）、一方面是科学发展的必然要求（当时育种工作、癌等的治疗都要求科技应有所突破）； 另一方面是有关基因结构与功能的基础理论研究的重大突破和技术的必然结果。 （3）、意义：基因重组技术使人类可以打破物种之间遗传物质转移交换的天然屏障；跨越生物远缘不能杂交的鸿沟，使人类有计划、有目的地进行在物种间甚至在动物、植物、微生物之间的基因杂交，达到有选择和定向性改变生物的基本性状，或融合进人们所需的优良性状，从而获得新的生物制品或制造出新的物种。更为

4、重要的是可以运用基基因工程技术方法去了解基因的功能以及基因调控的机理等一系列理论问题。另外在人类基因图谱绘制完成后，将有可能为人类征服各种疾病开辟新的途径。,一、基因工程的基本工具,基因工程的基本工具：工具酶、基因运载体和受体细胞。 （一）、工具酶：基因工程中所使用的酶类。 1、限制酶：凡能识别和切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸顺序的酶类，全称是限制性核酸内切酶或限制性内切酶核酸。 （1）、限制酶的命名：是根属名和种名相结合的原则。 如：来自Haemophilus aeygtius(埃及嗜血杆菌)的三种酶为：Hae 、Hae、Hae;,Haemophilus influenzae Rd(流感嗜

5、血杆菌)的三种酶为： Hind 、Hind、Hind; Haemophilus influenzae Rf的三种酶为： Hinf 、Hinf、Hinf; 当同属不同种的两种菌名前两个字母完全相同时，则其中一种的酶的符号改用种名词头后第一个字母（小写）代替三字母中最后一个字母如：Haemophilus parainfluenzae 的二种酶为： Hpa 、Hpa;而Haemophilus parahaemolyticus 的二种酶为： Hph 、Hph。,（2）、限制酶的分类： 第一型为单一多功能酶，由三种不同的亚基组成，辅因子为ATP、Mg2+及S-腺苷蛋氨酸，其甲基化位点与识别位点相一致，切

6、割后产生的DNA片段5-末端去掉磷酰基后形成的羟基末端不能作为多核苷酸激酶磷酸化的底物，所以不宜作为工具酶。 第二型 限制酶由两个相同的亚基组成，分子量在2-10万道尔顿之间，仅具有限作用，辅助因子仅为Mg2+，识别位点具有旋转对称性，切割位点与识别一致，其底物为双螺旋DNA。它是基因工程的理想工具酶。,第三型限制酶由两种亚基组成，具有双重功能，辅因子为ATP、Mg2+，也受S-腺苷蛋氨酸激活，但不是必需。具有特定识别顺序，甲基化位点与识别位点相一致，其功能还有待研究。 第二型限制酶的特点： （1）、具有很强的底物专一性，其底物只能是双链DNA分子，对单链RNA及双链DNA-RNA杂交分子均不

7、起作用； （2）、具有很强的位点专一性，它的识别位点为4-7核苷酸序列，甲基化位点就是识别位点，识别位点也切割部位；,（3）、位点上核苷酸顺序通常呈双重螺旋结构。 其切割 方式有三种： EcoR ： 5GAATTC3 3CT TAAG5 5G AA TTC3 G5 3CTT AA Hind ： 5NAAGCTTN3 3NT TCGA NA5 5NA AGCTTN3 3NTTCGA NA5 Sma ： 5CCCGGG3 3GGG CCC5 5CCC GGG3 3GGG CCC5,(4) ：影响限制酶活性的因素： 底物的纯度； DNA的甲基化程度； DNA分子结构； 反应温度； 反应缓冲液。 终止

8、限制酶反应的方法：加热失活，65保温5分钟；如是耐热酶，则可用脲、SOS、及胍等变性剂使之失活。,2、DNA连接酶及T4-DNA连接酶,问题：什么是连接酶？作用机理如何？两种连接酶各有什么特点？ 能催化DNA片段5-磷酰基与3-羟基形成磷酸二酯键的酶。 T4-DNA连接酶是T4-噬菌体编码的一种重要连接酶 机理 特点： DNA连接酶只能封T4-DNA连接酶闭缺口，而不能封闭裂口；只能连接粘性末端，不能连接平整末端。 T4-DNA连接酶具能连接粘性末端，又能连接平整末端。 但用量大。,（二）、基因工程载体和受体系统,问题：什么是载体？如何分类？做为载体必须符合哪些条件？基因 工程为什么要用载体？

9、什么是受体、克隆和重组体（重组子）？ 载体：能将目的基因运载进生物细胞并在其中自我复制的遗传因子。 分类（P13）： 做为载体必须符合哪些条件： 在细胞中能自我复制，即本身是复制子可繁殖性； 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片断后，不影响其本身的复制功能可利用性； 在基因重组中有12个筛选标记从而容易进行选择具有便利性； 分子小，多拷贝，安全性好，适应性强，容易控制，便于表达待。,在基因工程中，载体一般是用天然质粒或病毒为材料，经过人工改造或重新构建而成，改造的目标是增加它们作为无性繁殖的有效性及安全性。改造的内容有（1）、质粒改小，以增加有效的装载量和拷贝数； 1

10、、质粒载体（Plasmid Uector）： 问题：什么是质粒载体？有何生物特征？做为理想的质粒载体是哪一类？ （1）、质粒载体是染色体外能自我复制的双链闭合杂环状DNA分子。 （2）、同学自学。 （3）、类型：根据DNA分子中是否含有接合转移基因 分为接合型质粒和非接合型质粒； 根据拷贝数多少可分为低拷贝“也称为严紧型”和高拷贝“也称为松驰型”质粒。,（4）、介绍PBR322质粒： PBR322质粒最早是由Boliver待人构建，多年来广泛采用并经改进，产生了更有用的质粒载体。 PBR322质粒是大肠杆菌质粒载体，有万能质粒载体之称。它是由 PSF2124、PMB8、PSC101三个亲本质粒

11、经过复杂的重组构成的。 PSF2124带有氨苄青霉素抗菌素基因（Ampr）； PMB8带有COEL（大肠杆菌素因子）松驰型复制子； PSC101带有一个四环素抗性基因（Tetr）。 因此PBR322质粒是一个带有（Ampr）和（Tetr）标记的松驰型质粒载体。,2、噬菌体载体； 3、病毒载体； 受体：用于扩增载体及目的基因 的细胞。 克隆：目的基因的扩增过程。 重组体（重组子）：携带重组DNA分子的受体细胞。 对受体要求： 对人体无害： 繁殖能力强、生长速度快、从而在短时间内能产生 大量的后代，得到大量的基因拷贝和产物； 限制系统缺陷，对外来DNA不降解； 有蛋白质的加工修饰能力。如糖基化、氨

12、基化和磷酸化等。,二、基因工程的基本操作程序,基因工程是将一个基因片断插入到一个载体中，构成重组体，再导入宿营主细胞进行复制扩增，即进行无性繁殖。因此，任何DNA克隆都包括四个步骤： 获取载体裁DNA和目的基因把目的基因和载体在体外连接将人工构建的重组DNA 导入宿主细胞进行扩增选择与鉴定重组的克隆。,（一）、目的基因的获得,问题：什么是目的基因？什么是外源基因？获得目的基因的方法和原理是什么？ 目的基因：我们通常将哪些已被或要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或控制某一性状。,外源基因：把插入到载体内的那个特定的DNA片断。 关系：外源DNA不一定含有目的地基因。

13、 方法： 1、物理法： 原理是从几个方面来利用核酸DNA双螺旋之间存在着碱基G和C 配对，A和T配对的特性差别，以达到生物基因分离目的基因的目的。 （1）、密度梯度离心法： （2）、单链酶法： （3）、分子杂交法： 2、化学法合成基因：,条件：已知某种基因的核苷酸序列或者根据某种基因产物的氨基酸序列。 缺点：反应专一性不强，副反应多，合成片段越长分离纯度化困难，产率越低，而且合成能力有限一般局限于150-200bp。 3、化学与酶促相结合的合成法（P20）： ：,4、从基因文库（gene library）中分离基因,基因文库（gene library）：是指汇聚某一生物染色体所有DNA序列的重

14、组DNA群体（转化子群）。它是将一种生物的基因储存在可以长期保存的重组体中。 基因探针：是一段带有放射性或非放射但有其它类似放射性标记的与待查基因或其邻近区段的核苷酸顺序互补的核苷酸片断。,5、逆转录法： 逆转录法即利用逆转录酶由mRNA逆转录合成 的方法。 主要是合成分子量大而又不知道其序列的基因。 原因（P23）： 方法：与目的基因的mRNA为模板借助逆转录酶合成互补双链DNA分子，即cDNA（单链）再在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA片断与适当的载体结合后转入受体菌扩增为cDNA文库采用适当的方法从cDNA文库中筛选出目的基因。如家兔和从的珠蛋白质基因等。 ：,6、聚合酶链技术（PCR

15、）,聚合酶链技术（PCR）是1985年美国加利福尼亚的Mullis等到人开发的一项专利技术。,定义：是指在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以单链DNA为模板与寡聚核苷酸为引物，经DNA聚合酶催化合成DNA互补链的过程。 PCR的操作体系中含有：双链模板DNA（即目的基因）、热稳定的DNA聚合酶；一对引物和合成时所需要的原材料（dNTP） 方法：高温变性（双链模板DNA在900-950加热30-120分钟）； 低温退火（50-60 ） 适温延伸（72 ） 如此再重复循环，则目的DNA片段的数量就呈指数性扩增。,（二）、目的基因与载体DNA的连接,问题：什么是基因重组？进行基因重组前应考虑

16、哪些问题？基因重组常用的方法有哪些？ 基因重组：就是利用限制酶和其它一些酶 类切割和修饰载体DNA和目的基因，将两者连接起来，将目的基因插入到自我复制的载体内，再转入受体细胞。以期这种外源性的目的基因能在受体细胞内正确表达。 考虑的问题：必需结合研究目的基因的特性，认真设 计最终构建的重组体； 实验步骤要尽可能简单易行； 采用的方法要使重组体分子在连接混合物中占有较大的比例。,方法： 1、插入灭活法：将外源基因插入选择性标记使其灭活的方法 。 优缺点：是在连接反应中，易产生载体及目的基因的环化作用，以及载体和目的基因自身聚合作用，影响杂合重组体。,2、定向克隆法P26：将目的基因按正确的方向插

17、入载体的方法。 优缺点：不产生自身环化现象，但载体和目的基因仍可产生线性聚合体。,3、同聚物接尾法：在载DNA及目的基因两端分别接上能相互配对的同一个碱基聚合单链的重组过程。,优缺点：对载体及外源DNA的切割部位无特殊的限制，具有任何末端的DNA 及载体均可通过此法重组；载体与基因均不产生自身环化与线性聚合体；方法简便、应用范围广。 若载体和目的基因中间存在裂口，则也可产生同聚作用，退火时将产生复杂而无感染力的重组分子，影响转化率。 4、双接头法：在目的基因两端分别接上不同的化学联接器，然后与载体同时用两种不同的限制酶切割，再将切割产物连接的方法。 方法：在T4-DNA连接酶的作用下将不同联接

18、器联接到目的基因的两端经两种不同的限制酶切割后，再与载体重组。,5、平接法：具有3-羟基和5-磷酸酰基的平末端DNA片断之间，在T4-DNA连接酶的作用下，形成共价结合的过程。 优缺点：是DNA重组中最简单的一种方法，任何齐平末端外源DNA片段及载体之间均可以进行重组。在基因工程中用途较大，对于没有交错切割位点的外源DNA片段的重组，具有特别重要的意义。但反应速度慢，仅为粘接法的1%， T4-DNA连接酶用量大，为粘接法的10-30倍。 作业题：在重组实验中，如何防止或消除自身再环化作用和线性聚合体？ 影响连接效果的因素有哪些？,（三）、重组DNA导入宿主细胞,问题：体外构建的重组DNA为什么

19、要导入宿主细胞？P28 1、重组体DNA的转化或转染： 问题：什么是转化？什么是转染？两者有何异同？什么是转化率？什么是转化频率？ 转化（transformation）：是一种外源DNA分子或片断进入受体细胞使后者获得新的遗传性状的过程。 转染（transfection）：裸露的病毒DNA或RNA感染寄主细胞的过程。 两者之间的关系：两者的不同是DNA的来源不同。而过程相同的， 也就是说本质上两者之没有根本的差别， 所以习惯上人们往往也把转染通称为广义的转化。,转化率：指转化细胞占受体细胞的比例。 转化频率：指在受体细胞过量的情况下，重组DNA所能获得的转化子的菌落数。 影响转化率的因素：第一

20、，宿主限制-修饰系统的影响； 第二，宿主细胞人工感受态形成率对转化率有重大的影响； 第三，重组DNA的构型与转化率也有关； 第四，外源基因与宿主染色体DNA的同源性与转化率也有关； 第五，转化体系中重组DNA的浓度与纯度对转化率有一定的影响。,2、重组体DNA的体外包装及入噬菌体的转导： 问题：什么是转导？什么是体外包装？体外包装的基本原理和方法怎样？ 转导：以病毒为介导（载体）将遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞的过程。 在基因 工程中，是指借助温和噬菌体或病毒的感染作用将重组的DNA转移至宿主细胞的过程。 限制 性转导：由温和噬菌体和病毒DNA为载体构成的重组DNA分子，经体外包装成完整的

21、噬菌体或病毒颗粒的转导作用。 广义转导：任意DNA片断或重组DNA 分子经体外包装完整的噬菌体颗粒的转导。,所谓体外包装：就是在体外将重组的DNA放置到噬菌体的外壳里，然后通过正常的噬菌体感染过程，将它们导入宿主细胞。 体外包装采用噬菌体感染过的大肠杆菌溶解液，也就是包装提取物（packaging extract）进行的。 包装提取物（packaging extract）包括： E蛋白：是噬菌体头部的主要成分。 D蛋白：位于噬菌体头部外侧并与噬菌体头部成熟有关。 A蛋白：与入噬菌体DNA插入头部，与粘性末端形成有关。 Z蛋白：是尾部的主要成分。 得到包装提取物的方法 ：,一种是虽然可以从入噬菌

22、体直接提取到包装蛋白，但是这种方法比较复杂，不能成为常规技术。 另一种方法 是采用E基因变异株和A基因变异株（E-和A-）或（E-和D-）的入噬菌体感染大肠杆菌。 以入噬菌体作基因载体进行基因克隆有以下优点： 具有很大的外源DNA包容能力，对外源基因的克隆效率高； 有非常高的入重组回收率，特别是适用于建立基因库； 具有正性筛选性质。,（四）、重组体克隆的筛选与鉴定,问题：为什么要对重组体进行筛选和鉴定？ 筛选的方法如何？原理如何？ 方法：遗传检测法、核酸杂交法、免疫化学法、物理检测法和DNA顺序法等。 依据是根据载体体系、宿营主细胞的特征以及外源基因在受体细胞表达不同，即： 直接筛选方法：是针

23、对载体携带的某种标记基因和目的基因而设计的筛选方法。特点是直接测定基因和基因表型。,间接筛选是不直接测定基因，而是利用其它方法，例如利用特异性抗体与目的基因表达产物相互作用对重组体的筛选。 1、利用表型 特征筛选（遗传检测法）： 表型 是指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其它特征。 这些特征一个是克隆载体提供的这是最主要的也是应用最多的；另一个是插入的外源DNA序列提供的，相对来说数量较少。 （1）、抗药性标记插入灭活筛选法： 原理： 特点：是一种简便快速的方法 。但有时由于试剂或操作规程方面的原因，自身环化的载体分子有时也会失去特定的遗传标记。,（2）、-半乳糖苷酶显色反应选择法：

24、原理： 优点：是更为简单的方法 。 2、利用插入序列提供的表形特征筛选。 这种筛选要求： （1）、克隆的DMA片断是一个完整的基因序列； （2）、而且能够在大肠杆菌中实现功能表达。 这无疑是一个很大局限，特别是对真核基因。 3、利用核酸杂交技术筛选： 从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛应用的是核酸分子杂交技术。它是根据核酸杂交原理，利用基因探针捡测出培养平板上重组转化体菌落的位置。故也称为原位杂交技术或菌落（噬菌斑）杂交。,核酸杂交技术：用基因探针与样品中的DNA或mRNA进行杂交以检测其中是否含有目的基因或目的mRNA存在的技术。 原位杂交技术：让含有重组体的菌落或是噬菌斑，

25、由平板转移到膜上并释放DNA ，变性并固定在膜上，再同DNA探针杂交的方法。 方法：培养影印溶菌固定显色对号取菌。 优点：可以广泛的应用。特别是适合于大量群体的筛选。,3、利用免疫学方法筛选： 免疫学方法是间接筛选方法，也就是利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选的方法。,这种方法的优点是特异性强、灵敏度高、特别是适用于选择不为宿主提供任何选择标记基因的筛选。 （1）、放射性抗体检测方法： 原理：一种免疫血清含有IgG抗体，它们识别抗原分子的不同决定簇，并分别与各自的抗原决定簇相结合。抗体分子或抗体的F（ab）部分能够牢固地吸附在固体基质（例如聚已烯等塑料制品）上。而不会被洗脱掉， 通

26、过体外碘化作用，IgG抗体便会被放射性同位素125I 标记上。 方法：培养影印裂菌覆盖处理获取所需的重组克隆。,（2）、免疫沉淀检测法,这种方法相对于放射性免疫法来讲，灵敏度要低，而且易受干扰。但是它的价值在于操作简便易行。 方法：在生长菌落的琼脂培养基中，加入专门抗这种蛋白质分子 的特异性抗体。如果有些菌落的细胞能分泌出目的蛋白，就会在它的周围出现一条叫做沉淀素的抗原-抗体沉淀物所形成 的白色园圈。 这种方法的缺点是只能检测分泌出细胞的蛋白质，这就限制了该法的应用。要用来检测非分泌的蛋白质，需要对该法进行改良。,4、转译筛选法,概述：在基因工程中。通过基因重组，筛选的最终目的是获得高表达的基

27、因工程细胞，通过工程化生产有用的物质。因此所获得的重组体能否表达相应产物是关键的问题。采用相应的技术检查工程细胞目的产物表达情况是直接最有效的手段。目前用于检查工程细胞目的产物表达情况的转录-翻译系统有： （1）、小细胞转译系统： 原理：某些大肠杆菌在生长过程中能产生含重组质粒而不含宿主DNA的无生命小泡称为小细胞。 如果小细胞中含有重组质粒，则合成的蛋白质是重组质粒所编码的，故可用于检测重组质粒表达情况。,方法：将重组DNA转化到能产生小细胞的大肠杆菌中， 通过选择与培养即可获得含重组DNA小细胞用速度沉降法离心，分离出小细胞如果表达的产物是蛋白质，则在反应体系中加入35S-met 及其它的

28、氨基酸原料，即合成蛋白质然后将合成的产物用SDS-PAG电泳分析，并进行自显影就可以检测重组质粒表达情况（如产物的种类、大小与相对含量）。 ：,（2）、大细胞转译系统,应用紫外线多次照射含重组DNA的大肠杆菌细胞，细胞生长停止，染色体不能复制和蛋白质合成终止。这种状态的细胞称为大细胞系统。 方法与小细胞转译系统相同。,（3）、无细胞转译系统： 无细胞体系是一种具有高水平翻译能力的体外合成反应系统。这是由具有高水平翻译能力的动、植物及微生物细胞制备的。如大肠杆菌、小麦胚、玉米胚、果蝇等。 无细胞合成体系的成分相当复杂，其中含有RNA聚合酶、核糖体、tRNA及能合成系统。还需要加入各种氨基酸、磷酸

29、肌酸激酶、磷酸肌酸、无机离子及还原剂等。在反应系统中加入重组DNA及35S-Met 后即可实现转录和翻译。合成重组DNA编码的蛋白质，产物经SDS-PAG电泳，自显影以及水解后指纹图谱分析，即可判断目的基因的表达结果。,5、物理筛选法,（1）、电泳筛选法： 原理：根据带有插入片段的重组体DNA在分子量会有增加，然后分离质粒DNA并测定其分子长度，是一种直接的方法。 优点：比抗药性插入失活平板筛选法更进一步。 （2）、R-环检测法： 原理：R-环指的是RNA通过取代与其序列一致的DNA链与双链杂交，被取代的DNA单链与RNA：DNA杂交双链所形成的环状结构。 由于杂交双链DNA：RNA分子 比双

30、链DNA：DNA分子 更为稳定。那么将RNA及DNA相互混合，创造接近DNA变性的条件，RNA便会同它的双链DNA中的互补序列退火形成稳定的DNA：RNA杂交分子，而使被取代的另一条链处于单链状态。R-环一旦形成就十分稳定，而且在电子显微镜下可以观察到。 处理：在百分之70的酰胺缓冲溶液中接近变性温度。,五、目的基因的表达与调控,问题：1、目的基因表达必须具备怎样的条件？ 2、制约目的基因表达式的因素是什么？ 3、什么是表达体系？,1、目的基因表达必须具备怎样的条件？,概述：不论基因工程的研究目的如何，最终均涉及到目的基因的表达问题。绝大多数的基因工程研究是以获得基因表达产物为目标。此外，有时

31、基因工程的目的是研究基因结构与机能的关系，进行这种研究时，需要将天然的或人工突变的基因片断插入含有一定报告基因的载体的适当部位，比较天然基因与突变基因对表达水平的影响，从而分析目的基因的结构与功能的关系。那么基因表达必须符合下列条件： （1）、基因的密码区不能被插入序列所中断： （2）、基因必须在启动子的控制之下，而启动子必须被宿主细胞的RNA聚合酶有效地识别；,（3）、mRNA必须相当稳定，并且被有效转译。产生外源的蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所水解。 2、制约目的基因表达式的因素是什么？ 外源基因在受体细胞内表达与否以及表达水平受到很多因素的制约，其中主要有： （1）、外源基因是否插入在

32、正确的阅读框架； （2）、目的基因的有效转录（启动子的作用）； （3）、mRNA的有效翻译（如SD序列等作用）； （4）、转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程等。 这些因素在不同的表达体系又是不同的，这种不同不但与基因的来源、基因的性质有关，而且与载体和受体细胞有关。,所谓阅读框架：是由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列。 外源目的基因自己必须置于正确性的阅读框架之中，也就是说外源基因只有在它与载体上DNA的起始密码相吻合时，才算是处于正确的阅读框架之中。 所谓启动子：是指一段DNA序列，它能指导RNA聚合酶连接在DNA模板上，并开始合成mRNA。 不同的启动子效率 不同，强的启动子指导产生

33、较多的mRNA，弱启动子指导下转录合成 mRNA很少。 启动子有明显的特点：每个启动子序列都有两个高度保守的区域。即保守序列（原核DNA链能被外切酶水解，唯独启动子区有一区核苷酸对抗被水解而保持完整序列，这一区RNA聚合酶的结合得到保护，故名）,另外，外源基因要在宿主细胞中高效表达，除了有强的启动子外还要在翻译过程要求合适的条件。例如在mRNA链上要有一个可利用的核糖体结合位点，以确保mRNA能被有效翻译。在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点：一个是起始密码子（AUG或CUC），另一个是起始密码子上游311bp处的39bp的序列称为SD序列。 SD序列与大肠杆菌中rRNA的16S亚

34、基未端序列是互补的，通过互补作用，核糖体与m链连接起来，开始翻译过程。那么影响翻译的因素主要有： （）、 SD序列与rRNA的16S亚基未端 序列之间的互补程度是影响翻译的主要因素；,（2）、起始密码子AUG与SD序列之间的距离以及SD序列的核苷酸组成也影响翻译能力； （3）、起始密码之后的第一个核苷酸对mRNA与核糖体的结合也有影响； （4）、基因末端的转录终止区的影响。 外源基因末端要安装好启动子，还要注意到终止区的设计。否则转录的表达的过程可能会： 第一是转录与翻译物不必要地加长，增加了细胞能量的消耗，产生大量无用的蛋白质； 第二是转录可能形成不理想的二级结构，从而降降低了翻译的效率；

35、第三是可会发生启动堵塞现象，也就是从克隆基因的启动了开始转录可能于扰另一个重要基因的转录和翻译。,3、什么是表达体系？,所谓表达体系：是由目的基因、表达载体与宿主细胞组成的完整系统。分为原核表达体系和真核表达体系。 原核宿主系统是最早开发的基因表达系统，业已证明在合适的调节控制下，通过调整基本条件，做出正确设计，任何来源的基因都可以在原核宿主细胞中获得表达。尽管 如此，利用真核细胞作宿主表达系统还是具有明显的优点：真核细胞能识别和除去外源基因的内含子，切接加工形成成熟的mRNA，也就是说真核细胞带内含子的天然基因是可以利用的，这是原核细胞办不到的； 真核细胞将表达的蛋白质糖基化，而大肠杆菌表达

36、的蛋白质是没有糖基化的，糖基化对于某些蛋白质（如乙肝疫苗）的免疫原性影响很大。,真核细胞作为宿主表达系统尚存在以下几个问题： 一是选择标记及选择系统只有少数几个； 二是转化真核细胞的效率 低，一般只有10-610-4； 三是外源基因转移并整合到细胞染色体DNA上带有一定的自发性和盲目性，整合的拷贝数和位置都不能控制； 四是细胞培养和转化细胞的选择要求比较高，手续繁琐且费时。 此外，细胞培养还有不少问题，而且成本较高，利用培养细胞方式大量生产某些表达蛋白质，从式艺到成本都需要很好的考虑。,当前，利用基因工程生产蛋白质制品主要以原核细胞为受体细胞，用发酵法大规模生产。下面以大肠杆菌为例来说明原核表

37、达体系： 在肠杆菌是基因 工程采用最多的蛋白质表达体系，原因是；培养方法简单、迅速、经济又易于掌握，再加上人们运用大肠杆菌表达外源基因有二十多年的经验。 运用大肠杆菌表达外源基因，必须采用符合以下条件的载体： （1）、含大肠杆菌适宜的选择标记； （2）、具有能控制转录，产生大量mRNA的启动子。如lac（是控制lacz基因转录的序列，编码-半糖苷酶）和tac（由trp启动子与Lac启动子杂合而成，但比二者更强，并仍可被IPTG诱导）。,（3）、含适当 的翻译调控序列如核糖体结合位点和翻译起始点； （4）、具有多聚接头。 大肠杆菌表达体系的缺点： （1）、表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或糖基

38、化修饰； （2）、表达的蛋白质常常形成不溶性包涵体，要使具有活性还需要经复性等处理； （3）、很难大量表达分泌性蛋白质。 这样就使得原核基因表达受到限制。因此开发适合 的真核基因的表达体系将会使基因在工业生产领域的应用变得更广泛，更有实际意义。,真核细胞表达体系的特点： 1）、由于真核细胞内具有一系列剪切酶，外源基因的内含子可以被自动剪除真核细胞，并成功表达目的多肽。它不象原核细胞表达体系那样必须从mRNA制备DNA； 2）、真核基因在真核细胞中表达时，其SD序列与细胞核糖体rRNA16S亚基3|末端的互补程度高，对翻译水平的调节有利； 3）、在真核细胞内，由外源基因表达的蛋白质可被糖基化，可

39、为糖蛋白，有利于保持或提高免疫原性； 4）、外源基因导入真核细胞的效率较低，其在染色体DNA上的整合是随机的和自发的，目前还无法控制整合的位置和适当的拷贝数；,5）、真核细胞的培养要求较高，大量生产比较困难，成本也高。 目前做为真核表达载体的代表是酵母表达体系，酵母表达体系是最重要真核表达体系。 特点是酵母基因组较小，只是大肠杆菌的4倍，增殖一代所需的时间也只要几个小时。因此，像原核细胞那样易于操作，又可以用于真核细胞内复杂现象的研究。并已成功地用于人的干扰素和乙型肝炎疫苗，组织型血纤维蛋白溶源激活因子，胰岛素和水蛭素的表达生产。 目前尽管已开发出很多酵母，但酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母仍然是主要

40、用于大规模蛋白质生产的酵母，酿酒母是最好的宿主细胞，并且是遗传上安全的生物，可以应用或装配很多类型的载体。,使用酵母表达体系应注意以下方面： 1）、由于酿酒酵母不能识别和处理高等其核的内含子、故必须使用cDNA； 2）注意所表达蛋白质的性质，因为这将决定在胞内表达还是向外分泌； 3）启动子和终止子的选择； 4）表达盒的稳定性（有效的启动序列，目的蛋白cDNA和转录终止序列）； 5）、外源蛋白的积累部位。,哺乳动物细胞表达体系,培养哺乳动物细胞能生产天然状态的复杂蛋白质。 这种体系优越性是：它表达的高等真核蛋白总是正确地被修饰，这种修饰包括二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异

41、性蛋白酶进行的裂解等等，这些加工在原核细胞是做不到的。 如果所表达的是具有生物功能的膜蛋白或分泌性蛋白，如细胞表面的受体或细胞外的激素或酶，那么更只能由哺乳动细胞来表达； 哺乳动物细胞所表达的蛋白质几乎总是在恰当的细胞内一定区域累积。,缺点：是组织培养技术要求高；培养和筛选一个高度扩增的转化子细胞，通常要数月时间，难度较大。但这样的细胞一经产生，即可在液氮中较长久的保存。 作业题：如何提高克隆基因表达效率？,生长激素释放抑制因子基因式 在大肠杆菌中的表达,问题：1、什么是生长释放抑制因子（Somatostatin）? 2、有何实用意义？ 3、为什么Itakura实验室选用脑激素基因做模式来研究

42、真核基因在原核细胞中的表达？ 生长释放抑制因子（Somatostatin）是从哺乳动物下丘脑组织分离出的一种多肽激素。又称脑激素。 脑激素是1977年K，Itakura实验室采用化学合成方法合成出该基因，并成功地导入大肠杆菌，实现了功能表达，这是高等生物基因通过工程途径，第一次大原核生物细胞中获得功能性表达的重大突破。,实用意义：抑制生长激素、胰岛素和胰高血糖素的分泌。用于治疗肢端肥大症、急性胰腺炎和糖尿病等多种疾病，在临床医学上具有重要意义。 3、为什么Itakura实验室选用脑激素基因做模式来研究真核基因在原核细胞中的表达？ 原因：1）、脑激素分子小（只有14个氨基酸残基的小肽），因而易于

43、操作； 2）、氨基酸序列已经了解清楚，为基因的化学合成提供了基础； 3）、检测手段成熟（当时已经掌握了检测脑激素的有效手段，包括敏感性很高的放射性免疫测定法和生物学测定法）：,4）、在临床医学上有很大的应用价值。 5）过去，按传统的方法，从50万只羊脑组织中只能分离到5ml脑激素制品。材料来源困难、价格昂贵，严重地限制了对脑激素的研究及医学上的应用。现在，只要9升发酵液，就可以生产出相当于50万只羊脑的脑激素产品。 实验设计方法： 1）som基因化学合成的设计 我们知道，脑激素是一个小肽激素（14肽），aa 的序列清楚，按遗传密码则可以推测出它的mRNA的全部顺序、再按互补碱基配对原理推测出其

44、结构基因顺序。,由于一种aa 可有几种密码子，在选择上尽可能地用有利于基因表达的密码子，尽量排除造成分子内或分子间配对的密码子。根据这些考虑，设计出8个寡脱氧核甘酸片段，连成一个大段片P45图2-26。 在这个大片段中，含有生长激素释放抑制因子结构基因，在氨基端aa之前设计为甲硫aa密码子，在羧基端密码子为2个无义密码子，这样有利于起始和终止。另外，为了使som基因容易插入到基因载体上，在大片段两端加EcoRI和BamHI识别的粘性末端。 2）基因载体的设计和改造。 应用PBR322及其改造后的PBH20质粒作为分子载体。 在PBH20质粒上引入plac上的HaI片段，即含有乳糖,操纵子的启动

45、子，CAP的结合位点，操纵基因，核糖体结合位点及半乳糖结构基因7个aa片段。这样使som基因处于lac操纵子调控系统之下，使外源基因的调控系统与受体细胞的表达机构统一起来。 3）进行重组和引入细胞（E.coli） 4）体内表达与体外处理： 在产生脑激素的克隆中，重组质粒指导合成出的脑激素是与-半乳糖甘酶的保护，合成的脑激素多肽才不会被蛋白酶所水解。在体外，经过溴化氰的处理，便可以将脑激素从融合蛋白上切割下来。 这个研究成果，在理论上解决了真核基因在原核细胞中的表达问题，在实践应用上，为在基因工程工业中通过发酵途径，生产出大量廉价的医药产品开拓出新,路，这项研究以后，又实现了鼠和人的胰岛素基因在大肠杆菌中的功能性表达。 思考题： 1、除了化学合成法外，还可以用什么方法获得脑激素基因？ 2、人胰岛素基因在E.coli细胞中又是怎样表达的？P46-47。,