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1、Western blot,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。,1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNADNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。,而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。,埃德温迈勒萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern）,是什么？,DNA重组技术,siRNA
2、的转染技术,表观遗传学（甲基化，miRNA）,凡是涉及蛋白水平检测的研究，均可运用到western blot技术,能做什么？,为什么要作蛋白质印迹实验？ 研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中 蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。,Western Blot基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,Western Blot 基本原理,流程,一、 原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，
3、“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。,E,3.SDS-PAGE电泳,原理：,SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SD
4、S 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素,Western Blot 的具体步骤,膜,主要试剂,制胶用（1-6）： 1. 1.0mol/L TrisHCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调
5、pH至6.8），室温下保存。 2. 1.5mol/L TrisHCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 18.671g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。,3. 10SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4. 10过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 蒸馏水 1ml （现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4保存，保存时间为1周）,5 四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4C保存。
6、 6 30%丙稀酰胺： 4C保存。,下层胶 依次加入 去离子水 5.9ml 30%丙烯酰胺 5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150l 10%AP 150l TEMED 6l5% 上层胶 依次加入 去离子水 4.1ml 30%丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60l 10%AP 60l TEMED 6l,7 5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800m
7、l即可。,8 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。 通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀）,9 10XTBS缓冲液 Tris（MW121.14） 24.2g NaCl 80.0g 蒸馏水至 1000ml （浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。 101XTBST缓冲液 10XTBS缓冲液 100ml 蒸馏水 900ml Tween-20 1 ml 因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可
8、把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。 溶解后室温保存。,11封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)： 1XTBST缓冲液 95-100 ml 脱脂奶粉 5g 溶解后4保存，可于一周内使用。,其他试剂 一抗、二抗、显影液、定影液、ECL化学发光试剂 A 和 B 两种试剂,Western Blot 的具体步骤,3.SDS-PAGE电泳,凝胶成份： 丙烯酰胺 N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS 过硫酸铵 TEMED H2O,仪器：,电泳缓冲液： Tris-甘氨酸溶液,Western Blot 的具体步骤,3.SDS-PAGE电泳,1.制胶,需紧密固定！,Western Blot 的具体步骤,3.SDS-PAG
9、E电泳,2.上样,每孔上样量为20-50 g蛋白；根据目的蛋白的表达情况的不同而有所变化。,Western Blot 的具体步骤,3.SDS-PAGE电泳,3.电泳,电泳条件： 推荐：浓缩胶 80V 3545min 分离胶 120V 4575min,Western Blot 的具体步骤,3.SDS-PAGE电泳,SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色,Western Blot 的具体步骤,4.转膜,原理：,蛋白因结合SDS而带电荷，转膜即在电场作用下从胶中转至膜上的过程。,Western Blot 的具体步骤,4.转膜,半干式转膜速度快，适合与小分子量蛋白,湿式成功率高并特别适合用于分子量大于 1
10、00KD的蛋白,两种方法的转膜液不同！,Western Blot 的具体步骤,4.转膜,表5 PVDF膜、NC膜、尼龙膜特点比较,Western Blot 的具体步骤,4.转膜,转膜准备,制作“三明治”,Western Blot 的具体步骤,4.转膜,Western Blot 的具体步骤,4.转膜,转膜条件： 推荐：100V ，12小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。,Western Blot 的具体步骤,5.转膜后检测：（立春红染色）,为检测转膜是否成功，可用相关染料对膜进行染色。,1x立春红 5min,染色前,染色后,Western Blot 的具体步骤,6.封闭,封闭条件： 4C摇
11、动，封闭1 hour，再用 TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。,为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，常用的封闭液：,脱脂奶粉（5） BSA（5） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）,不能用于磷酸化蛋白！,Western Blot 的具体步骤,7.免疫反应,1.按照抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释抗体； 2.抗体孵育时间：室温下孵育12h或4过夜（一般不超过18小时）； 3. 保持适当的摇动使抗体与膜的结合均匀；,Western Blot 的具体步骤,7.免疫反应,摆床上，二抗杂交，室温（25左右）1h，或4过夜。,PBST(
12、TBST)洗涤3次，每次10分钟。,上二抗,Western Blot 的具体步骤,7.免疫反应,不同二抗稀释浓度的效果图,Western Blot 的具体步骤,8.显色（结果检测）,暗室操作！,Western Blot 的具体步骤,8.显色（结果检测）,滴加ECL工作液,显影、定影,Western Blot一般流程,蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳,转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,操作步骤,（一） 蛋白样品制备 （二） 蛋白含量的测定,（三） SDSPAGE 电泳,1） 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净
13、后立在筐里晾干。,（2 ） 灌胶与上样,1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）,2、按前面方法配 10分离胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时， 可用 10ml 枪吸取 5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。 然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）,3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。,4、配4 的浓缩胶
14、,加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。,5、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）,7、加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。） 用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢
15、加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次，以免交叉污染。,（3） 电泳,电泳时间一般45 h，电压为40V 较好，也可用 60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。,（四） 转膜,（1） 转一张膜需准备 6 张7.08.3cm 的滤纸和1 张7.38.6cm 的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h 才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。 若膜沉入水里，膜与
16、水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。,（2 ） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和 浸过的膜。 （3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以 擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫 三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去 其中的气泡。,（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。 撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。） 除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。 小
17、心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。 将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）,（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。 转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用 60V 转移2 h 或40V 转移 3 h。,(五) 封闭及杂交,1封闭： 将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍
18、加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。,2结合一抗： 一抗的准备：使用反贴法时每张39cm2膜约需2ml一抗稀释液。 反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。,3洗涤： 一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。,4结合二抗： 根据一抗来源
19、选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:10001:10000），室温轻摇一小时。 5洗涤： 二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。 封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200ml PBST,六） 化学发光，显影，定影 （1） 将A 和 B 两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min 后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min 后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入 X- 光片夹中。 （2 ） 在暗室中，将1显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X光片,用切纸刀剪裁适当大小（比膜
20、的长和宽均需大 1cm）；打开X-光片夹，把 X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号 的强弱适当调整曝光时间，一般为1min 或5min，也可选择不同时间多次压片， 以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为 12min （2025 ），温度过低时（低于 16）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 510min，以胶片透明为止；用自来水冲残留的定影液后，室温下晾干。 应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。,