《核酸.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸.ppt（174页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、核 酸 (Nucleic Acid),主要介绍碱基、核苷、核苷酸和核酸的结构、性质和功能，核酸的分离、提纯、鉴定等。,（一）核酸的概念,核酸英文名nucleic acid（NA）,1868年瑞士F. Miescher（米歇尔）发现了核酸。,一、核酸的概念和重要性,核酸是由几十个甚至几千万个核苷酸聚合而成的具有一定空间结构的大分子化合物。,（二）核酸的重要性,（一）类别,nucleic acid,（二）分布,二、核酸的类别、分布和组成,（三）组成,1碱基（base）：又称含氮碱,（1）嘧啶碱（pyrimidine, Py）,（2）嘌呤碱（purine, Pu）,其它嘌呤（核酸的代谢产物）：,黄嘌
2、呤、次黄嘌呤、尿酸等,（3）修饰碱基（modified base）： 也称稀有碱基（minor base）,（4）碱基的性质, 一般的物理性质, 互变异构现象,uracil 酮式,uracil 烯醇式, 碱基的紫外吸收,最大吸收峰在260nm附近, 碱基的解离,2戊糖（pentose）,（1）结构,-D-核糖,-D-2-脱氧核糖,-D-2-O-甲基核糖,（2）性质, 氧化反应, 碱水解,2-核苷酸3-核苷酸 混合物, 颜色反应,3磷酸（phosphoric acid）,（一）核苷（nucleoside）,1核苷的结构,核苷：含N苷，-苷,三、核苷、核苷酸,核苷中戊糖与碱基的连接方式：,腺嘌呤核
3、苷 （adenosine）,胞嘧啶脱氧核苷 （deoxycytidne）,核苷,核糖核苷（核苷）：A、G、C、U,脱氧核糖核苷（脱氧核苷）：dA、dG、dC、dT,命名，简写符号,天然核苷：一般为反式构象,2修饰核苷（modified nucleoside）： 也称稀有核苷（minor nucleoside）,修饰核苷包括三种情况:,（1）由修饰碱基和糖组成的核苷,（2）由非修饰碱基和2-O-甲基核糖组成的核苷,（3）由碱基与糖连接方式特殊的核苷,（1）,（2）,（3）,(),还有一些核苷，它们的碱基不是嘌呤环，但可把它们看作是鸟苷的衍生物，如Y核苷、Q核苷。,修饰核苷的简写符号,少数修饰核苷
4、用单字符号如D、I；但大多数修饰核苷是将碱基取代基、取代位置和取代数目写在核苷单字符号的左边，用小写英文字母代表取代基。,取代基用下列小写英文字母表示 :,例：,注意：,例: 2-O-甲基腺苷 Am,含修饰核糖的核苷即2-O-甲基核苷的表示方法，在核苷符号的右下方注上一个小写m。,3核苷的性质,（1）物理性质,（2）互变异构现象,（3）紫外吸收：OD260,（4）两性解离,（二）核苷酸（nucleotide, Nt）,1核苷酸的结构,（1）（核糖）核苷酸（ribonucleotide）：,2，3，5一核糖核苷酸,(2-AMP),(3-AMP),(5-AMP),3，5一脱氧核糖核苷酸,Deoxy
5、adenosine 3- monphosphate (3- dAMP),Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP),（2）脱氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）：,（1）一般物理性质,（2）互变异构现象,（3）紫外吸收,2核苷酸的性质,4种单核苷酸吸收光谱的标准比值,光密度 比值,pH,核苷酸,A260：样品在260nm处的吸收值,E260：所测核苷酸的摩尔消光系数,C： 核苷酸样品的浓度（mg/ml）,核苷酸(mg) = Mr N V,胞嘧啶核苷酸的解离,（4）核苷酸的两性解离和等电点,4种核苷酸的解离曲线,可在pH2.05.0之间
6、分离各种核苷酸,pH3.5时各核苷酸所带电荷,1ATP类的高能磷酸化合物,（三）核苷酸的重要衍生物,2环状核苷酸,胞内,ATP cAMP + PPi,磷酸二酯酶,5-AMP,腺苷酸环化酶 （AC）,3核苷多磷酸类,（一）DNA的一级结构Primary structure,1DNA分子中核苷酸的连接方式,四、DNA的结构,53,RNA,简写方法：线条式、文字式,英国Sanger 1975年加减法，1977年末端终止法,美国Maxam和Gilbert 1977年化学断裂法,2DNA分子中核苷酸的排列顺序,（1）酶法（双脱氧法、末端终止法）,1提出DNA双螺旋结构模型的根据,（1）x-光衍射分析,2
7、0世纪40年代Astbury,1952年M.Wilkins,（二）DNA的二级结构,（2）DNA碱基组成的定量分析,20世纪40年代chargaff规则, DNA碱基组成有种的特异性，但没有组织、器官特异性。, A=T；G=C；A+G=T+C,2DNA双螺旋结构模型（double-helical structure）,1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构。,（3）碱基、糖、磷酸的位置。,DNA双螺旋结构要点：,（1）两条反向平行的多核苷 酸链，右手双螺旋。,（4）双螺旋的直径，螺距。,（2）大沟（深沟） 小沟（浅沟）,（5）碱基配对,（6）碱基的序列,稳定DNA双螺旋结构的
8、化学键,（1）互补碱基对之间的氢键,（2）碱基堆积力（base-stacking forces）,（3）磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键,3DNA双螺旋的种类,Watson Crick DNA双螺旋结构（B型DNA）,当DNA钠盐纤维相对湿度和盐的种类改变时， DNA的构象发生改变。,不同DNA纤维的空间结构,A-DNA：,与B-DNA相同处：,与B-DNA不同点 :,（1）螺体宽而短，直径2.55nm；11个核苷酸一圈，螺距2.46nm。,（2）碱基的倾角大一些：倾角19。,A-DNA：RNA分子中的双螺旋区；DNA-RNA杂交分子。,A-DNA和B-DNA之间可以相互转换，
9、推测在转录时，DNA分子发生BA的转变。,反向的两条多核苷酸链，右手螺旋。,C型DNA的一些数据与B型DNA很相似。,C-DNA：,4DNA双螺旋的研究进展,（1）Z-DNA,1979年美国ARich等人发现了左旋DNA（左手DNA双螺旋结构）,晶体X-光衍射分析,d(Cp Gp Cp Gp Cp Gp),Z-DNA的特点,Z-DNA的生物功能：,Zig-zag 之字,与基因表达、基因调控有关。,（2）三螺旋DNA,（3）四螺旋DNA,DNA,双链线状,双链环状,单链线状：动物病毒MVM,单链环状：噬菌体X174,真核细胞染色体DNA,噬菌体T2，T5，T7，P22,E-Coli染色体DNA,
10、线粒体DNA,叶绿体DNA,多瘤病毒DNA，病毒SV40DNA,噬菌体和X174的复制型,噬菌体T2DNA长约50m,E-coli DNA 长约1mm,人生殖细胞DNA长约1m,（三）DNA的三级结构,双链环状DNA（double stranded cyclic DNA, DSCDNA）,双链环状DNA在自然界是广泛存在的，如一些病毒DNA、一些噬菌体DNA、细菌质粒DNA、线粒体和叶绿体DNA等。,1共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）的超螺旋结构（superhelical structure）,形成超螺旋的基础:,DNA双螺旋的
11、扭曲形成超螺旋（superhelix）,负超螺旋,正超螺旋,超螺旋DNA的性质,结构紧密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。,变性,2开环DNA（open circular DNA, ocDNA）,也称松环DNA（relaxed circular DNA, rcDNA）,+,3连环DNA（Catenanes DNA）,单体,二聚体,1重复序列 （repeated sequence ）,（1）高度重复序列（highly repeated sequence）,卫星DNA（satellite DNA）,基因组（genome）,（四）真核细胞染色体DNA结构,主体DNA（bulk DNA）,卫星DNA
12、（satellite DNA）,（2）中度重复序列（moderately repeated sequence）,（3）单一序列（unique sequence）,2回文结构（palindromic structure）,(1) 回文结构,回文结构也称反向重复（inverted repeats）,(2) 发夹形和十字形,（一）RNA的类别,1核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）,2转移RNA（transfer RNA, tRNA）,3信使RNA（messenger RNA, mRNA）,五、RNA的结构,4其它类别的RNA,（1）病毒RNA（Viral RNA, rRNA）,（
13、2）核内RNA（nuclear RNA, nRNA）, 不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA,HnRNA）, 小分子核RNA（small nuclear RNA, sn RNA）, 小分子核仁RNA（small nucleolar RNA, sno RNA）, 染色体RNA（chromosomal RNA, ch RNA）,（3）线粒体RNA（mitochondrial RNA, mit RNA）,（4）叶绿体RNA（chloroplast RNA, chlRNA或ctRNA）,（二）RNA的一级结构,1RNA分子中核苷酸之间的连接方式,3,5-磷酸二酯键,2RN
14、A分子中核苷酸的排列顺序,酵母tRNAAla,小片段重叠法,直接阅读法（直读法）,1965年,3几类RNA的一级结构,（1） tRNA的一级结构,tRNA一级结构的共同点:, Mr较小（Mr25000），沉降常数4S。, 各种tRNA的链长很接近，一般在7393个核苷酸之间。, tRNA分子中约20多个位置上的核苷酸是保守的（不变和半不变的）, 各种tRNA的3一端为CCA；5一端大多数为pG，少数为pC。, tRNA分子中含有较多的修饰成分。,（2）rRNA的一级结构,原核生物核糖体,70S,50S,30S,5S rRNA， 23S rRNA,34种蛋白质,16S rRNA,21种蛋白质,真
15、核生物核糖体,80S,60S,40S,5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA,49种蛋白质,18SrRNA,33种蛋白质,（3）mRNA的一级结构,真核生物mRNA的一级结构可用下式表示 :,5-cap：m7G(5)pppNmp,5-cap,cap0: m7G(5)pppNp,cap1: m7G(5)pppNmpNp,cap2: m7G(5)pppNmpNmpNp,5-cap的功能,(1) 防止mRNA被核酸酶降解。,(2) 为mRNA翻译活性所必需。,(3) 与蛋白质合成的正确起始有关。,3-polyA : polyA的残基数20200个，或更多。,polyA的功能,(1) 保护mR
16、NA，免受核酸外切酶的作用。,(2) 与翻译有关，没有polyA翻译活性降低。,(3) 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。,（三）RNA的二级结构,大多数天然RNA是一条单链，通过自身回折形成部分螺旋区，部分非螺旋区。,少数病毒RNA如水稻矮缩病毒、呼肠孤病毒、伤瘤病毒等RNA是双链螺旋，类似于DNA的双螺旋结构。,RNA中双螺旋结构稳定的因素主要是碱基堆积力，其次是氢键。,1tRNA的二级结构,（1）aa接受臂（amino acid arm）,（2）二氢尿嘧啶环 （dihydrouridine loop, DHU loop）,（3）反密码环（anticodon loop）,（4）额外环（e
17、xtra loop）,（5）TC环（TC loop）,X光晶体衍射解出的 tRNA 立体结构,1980年牛心线粒体tRNAser只有63个核苷酸，沉降常数3S，缺少D环和D臂，呈二叶草型。,近年来发现2种线虫线粒体tRNA也不是标准的三叶草结构。,2rRNA的二级结构,3mRNA的二级结构,The secondary structure of HEC-SODs mRNA. the free energy of result is 587.9J.,（四）RNA的三级结构,tRNA的三级结构,六、核酸酶类,包括核酸水解酶、合成酶、连接酶等。,（一）核酸水解酶的分类,1底物：核糖核酸酶（ribonu
18、clease, RNase）,脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase）,2作用方式：核酸内切酶（endonuclease）,3按磷酸二酯键断裂的方式,4其它：如双链酶、单链酶等,核酸外切酶（exonuclease）,（二）核糖核酸酶类,1牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease, 简称RNase A或RNase I）,2核糖核酸酶T1（ribonuclease T1，简称RNase T1）,3核糖核酸酶T2（ribonuclease T2，简称RNase T2）,主要作用点为Ap残基，水解速度AUGC,（三）脱氧核糖核酸酶,1牛胰脱氧核糖核酸酶
19、（pancreatic deoxyribonuclease简称DNase I）,2牛脾脱氧核糖核酸酶 （spleen deoxyribonuclease, 简称DNase II）,3限制性内切酶（restriction endonuclease） 简称限制酶,限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，对自身起了保护作用。,发现概况:,（1）限制性内切酶的特征, 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点, 粘性未端，平整末端,（2）限制性内切酶的命名,EcoRI,（3）限制性内切酶举例,（四）非专一性核酸酶类（nonspecific nuclease）,介绍二种外切酶,1蛇毒磷酸二酯酶
20、（venom phosphodiesterase）,5-核苷酸,蛇毒磷酸二酯酶对末端磷酸基有严格的要求,橘青霉磷酸二酯酶专一性： 与蛇毒磷酸二酯酶相同,2牛脾磷酸二酯酶,对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸二酯酶相反,（五）磷酸单酯酶,将单核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸单酯键切开，得到磷酸和其它产物,1特异性磷酸单酯酶,2非特异性磷酸单酯酶,磷酸基无论在3或5位，都能水解，如E. coli磷酸单酯酶,（一）一般性质：分子大小、性状、溶解度。,分子大小：DNA Mr 1061010或更大,性状： DNA为白色纤维状固体，而RNA为白色粉末。,溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有机溶剂，微溶于水， 但它们的
21、钠盐在水中溶解度较大。,RNA Mr 104106或更大,七、核酸的性质和最常用的研究方法,（二）粘度,（三）酸碱性质,（四）紫外吸收,由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有强烈吸收，最大吸收峰在260nm附近，利用这一特性可进行核酸的定量测定。,1紫外分光光度法,首先根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度,纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0,（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低）,纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量,若260nm光吸收值为1相当于50g/ml双螺旋DNA,或相当于40g/ml单链DNA或RN
22、A,或相当于20g/ml寡核苷酸。,2摩尔磷消光系数（molar absorptivity）法,A：样品的光吸收值,C：每升溶液中磷的摩尔数,L：光径,在pH7.0时；DNA的 为6600, RNA的 为77007800。,：摩尔磷消光系数，也称摩尔磷吸光系数,知道了磷的含量就可知核酸的含量,3增色效应与减色效应,增色效应（hyperchromic effect）,减色效应（hypochromic effect）,（五）沉降特性,1核酸浮力密度的测定,浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度,氯化绝（CsCl）密度梯度沉降平衡,用12个已知浮力密度的标准DNA样品作参考,式中 ：未知DNA的密
23、度,0：标准DNA的密度,：角速度（弧度/秒）,r： 未知DNA与转轴之间的距离,r0：已知DNA与转轴之间的距离,2DNA中G-C含量的测定,G-C对的含量与浮力密度之间呈正比关系,Rolfe-Meselson导出了如下公式：,=0.100（G-C%）+1.658(g/cm3),知道了浮力密度就可计算出G-C对的含量,3核酸的构象和分离,：RNA环状DNA线状DNA蛋白质,DNA 沉降,（六）核酸的变性、复性和杂交,1变性（denaturation）,核酸变性的概念,引起核酸变性的因素,（1）热变性,结构：螺旋线团,理化性质：紫外吸收 粘度比旋光度,生物活性：生物活性或丧失,（2）熔点（Tm
24、）,Tm: 熔点，熔解温度， 变性温度，解链温度,（3）影响Tm值的因素, DNA的均一性, DNA中G-C对的含量,经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44, 盐离子强度,2复性（renaturation）,（1）复性,理化性质: 比旋光度 粘度,复性 也称退火,（annealing）,生物活性得到部分恢复,（2）影响复性的因素, 样品的性质, DNA的浓度, DNA片段的大小, 温度, 离子强度,（3）复性动力学,DNA的复性过程是一种双分子反应,S：single strand DNA,D：double strand DNA,经重排，积分等,式中 C0：t=0时，起始DNA的浓度
25、（mol/L）,C：t时间时，单链DNA的浓度（mol/L）,k：复性反应常数（L/molsec）,t：复性时间（sec）,Cot :,时的Cot值，即指复性完成一半时的Cot值。,3杂交（hybridization）,核酸的杂交：是指不同来源的单链核酸之间可通过 碱基互补形成双螺旋结构。,单链DNA与单链DNA杂交（DNA-DNA）,利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。,单链DNA与单链RNA杂交（DNA-RNA）,单链RNA与单链RNA杂交（RNA-RNA）,用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交,1975年英国E. M. Southern首创的Southern blotting（
26、Southern印迹）,原理,方法,探针：作为检测用的已知DNA序列或RNA序列的片段,1977年G.K.Stark首创Northern blotting （Northern印迹）,Western blotting（Western 印迹）,（七）凝胶电泳,核酸研究中最常用的方法,优点：简单、快速、灵敏、成本低。,通过凝胶电泳,（1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。,（2）测定分子大小。,（3）估计核酸的构象。,凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应,1琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）,琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。,2聚丙
27、烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis）,用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段,适用于大分子核酸，一般用于DNA分析。,（一）DNA的生物功能,1DNA与遗传,（1）DNA是主要的遗传物质,间接证据,直接证据,八、核酸的生物功能, 细菌转化作用 （transformation ）,肺炎球菌（pneumococcus）,1928年细菌学家Griffith 细菌毒性实验,1944年Avery细菌转化实验,转化作用：,转化作用的物质称转化因子,从一种细菌中得到DNA通过一定途径进入另一种细菌，从而引起后者遗传特性的改变。, 噬菌体感染实验,
28、1952年美国Hershey 噬菌体感染实验, 转导作用（transduction）, 人工合成基因的表达,3. DNA与遗传性疾病、癌变的关系,（1）镰刀状红细胞贫血病的DNA点突变,（2）白化病的基因缺失,（3）癌变,（二）RNA的生物功能,1RNA与蛋白质的生物合成,（1）mRNA与遗传密码,遗传密码（genetic code）,密码子（codon）,mRNA的主要功能,（2）tRNA的作用,tRNA的作用是多方面的，它接受氨基酸、携带氨基酸，把氨基酸转运到核糖体上，然后按照mRNA上的密码顺序装配成多肽或蛋白质。,tRNA必须识别相应的氨基酸和识别mRNA上相应的密码子。,tRNA怎样
29、识别相应的氨基酸: 主要靠高度专一的氨 酰-tRNA合成酶。,tRNA怎样识别mRNA上相应的密码子,（3）rRNA的作用,详见网上参考材料,九、核酸的分离、纯化和核苷酸的制备,（一）核酸的分离、提取通则,为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 :,1保持低温（04）。,2防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。,3防止核酸酶的作用。,抑制DNase：,可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。,抑制RNase：,（1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。,
30、（2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。,（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。,（二）大分子DNA的提取,1材料的选择,2细胞破碎,3DNA-蛋白质（DNP）的提取,真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白（DNP），RNA与蛋白质结合成RNP，而且DNP和RNP常常混在一起。利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的不同来分离DNP和RNP。,可用1mol/LNaCl溶液提取DNP。,相 对 溶 解 度,NaCl（mol/L）,DNP在NaCl中的溶解度,4去蛋白质,（1）SDS,（2）苯酚法,（3）氯仿法,（4）酚:氯仿:异戊醇25:24:1,5沉淀DNA
31、,6去杂质,（1）去RNA,（2）去多糖,7进一步纯化,生物材料,DNP（RNP）,DNP,纤维状DNA,较纯DNA,纯DNA,*原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。,破细胞,1.0mol/L NaCl*,去蛋白质,酒精沉淀,去RNA,柱层析，电泳,密度梯度离心,去多糖,（三）RNA的提取,1不同种类RNA的提取,2大分子RNA的提取,（1）酚提取,（2）酚-氯仿-SDS法,3mRNA的提取,4工业上制备RNA,（1）稀碱法,（2）浓盐法,（四）核酸纯度鉴定,1.A260/A280,2.电泳,（五）核酸含量的测定,1.定磷法,2.定糖法,3.紫外吸收法,（六）核苷酸的制备,1碱水解,2酶水解,3.自溶法,