核酸的组成与结构.ppt

《核酸的组成与结构.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸的组成与结构.ppt（52页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、1,第三章 核酸的组成与结构,本章重点：DNA和RNA的组成、结构和功能。 本章难点：DNA结构的多态性。,2,第一节 DNA的组成与结构,一、 DNA （deoxyribonucleic acid）的组成 1. 核酸是由许多个单核苷酸聚合而成的多核苷酸链;核苷酸由碱基、戊糖(D-2-脱氧核糖)和磷酸三部分构成。 2. DNA含：A、T、C、G四种碱基,3,二、DNA 的结构与功能,一级结构（Primary structure）： 指DNA分子中核苷酸的排列顺序。 二级结构（Secondary structure）： 双螺旋（double helix） 三股螺旋（triple helix） 三

2、（高）级结构（Tertiary structure）： 超螺旋（supercoil）,4,（一）DNA的一级结构 指DNA分子中4种核苷酸的连接方式和排列顺序。 1. Chargaff法则 Chargaff于1946-1950年根据纸层析、离子交换层析和紫外分光光度试验结果提出查伽夫定则：四种碱基的数量不是等量的；同一物种DNA碱基组成不变，而物种间则有很大不同；嘌呤碱基总量与嘧啶碱基的总量相等(A+G=T+C)，且腺嘌呤与胸腺嘧啶数相等“A”=“T” 、鸟嘌呤与胞嘧啶数相等“G”=“C”。 2.核苷酸序列及其测定 查伽夫定则表明：核酸并不是四核苷酸结构的简单重复，核酸的碱基序列信息可能具有重

3、要意义。以后的研究表明：碱基序列正是核酸生物学功能的基础，是遗传信息的内在形式。核酸序列分析技术是最重要的分子生物学研究技术，主要包括：Sanger双脱氧法和Maxam and Gillbert化学法。基于化学法的DNA序列自动分析仪已成为常规实验设备。,5,5末端的磷酸基团,3，5-磷酸二酯键,3末端羟基,DNA的长度单位：碱基对 (bp)，千碱基对 (Kb)，百万碱基对 (Mb),6,3. DNA一级结构的表示方法,线条式表示法,文字表示法,7,（二）DNA的二级结构 指两条核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。 1.DNA双螺旋结构模型 1953年美国青年生物学家Watsn和英国中年物

4、理学家Crick根据碱基互补配对规律和DNA的X射线衍射研究，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并为以后拍摄的电镜直观形象所证实，从而奠定了分子生物学的基础。 （1）要点：DNA分子是由两条同轴反向互相缠绕的多核甘酸链组成的双螺旋结构；糖和磷酸排在外面构成骨架,两链相应的核甘酸的碱基互相配对由氢键连接排列在内侧；双螺旋直径为20A，螺距为34A,包含10对碱基。 （2）意义：DNA双螺旋模型结构同时表明，DNA可以按碱基互补配对原则进行半保留复制，而在此之前对复制方式人们对一无所知；DNA核苷酸顺序规定该基因编码蛋白质的氨基酸顺序；DNA中的遗传信息就是碱基序列；并存在某种遗传密码(genet

5、ic code)，将核苷酸序列译成蛋白质氨基酸顺序。在其后的几十年中，科学家们沿着这两条途径前进，探明了DNA复制、遗传信息表达与中心法则等内容。,8,沃森、克里克和威尔金斯因发现生命的双螺旋而荣获1962年诺贝尔医学生理学奖。 （左一：威尔金斯，左三：克里克左五： 沃森）,Franklin RE，19201958）和同事威尔金斯在1951年率先采用X射线衍射技术拍摄到DNA晶体照片，为推算出DNA分子呈螺旋结构的结论，提供了决定性的实验依据。但“科学玫瑰”没等到分享荣耀，在研究成果被承认之前就已凋谢。,9,超高分辨率扫描式电子显微镜拍到的DNA照片,DNA的人工模型,富兰克林拍摄的DNA的X

6、射线衍射图,X衍射技术是用X光透过物质的结晶体，使其在照片底片上衍射出晶体图案的技术，这个方法可以用来推测晶体的分子排列；沃森和克里克从衍射图谱中受到启示。,10,DNA双螺旋结构模型,11,12,2.DNA分子构型的多态性 （1）右手螺旋：A-DNA、B-DNA、C-DNA、 D-DNA、E-DNA、T-DNA； （2）左手螺旋：Z-DNA。,B-DNA：为DNA在生理状态下的构型，右手双螺旋构型（沃森和克里克模型），每螺旋为10个核苷酸对。 A-DNA：为DNA的脱水构型，右手螺旋，每螺旋为11个核苷酸对。 Z-DNA：为左手螺旋，每个螺旋含12个核苷酸对。,13,DNA分子构型的多态性,

7、14,3.DNA的其它螺旋结构 （1）回文结构：DNA序列中以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同的双螺旋结构。即对称轴一侧的片段旋转180后，与另一侧片段对称重复。回文结构能形成十字结构和发夹结构。,15,（2）镜像重复(mirror repeat) ：存在于同一股上的某些DNA区段的反向重复序列。此序列各单股中没有互补序列，不能形成十字型或发夹结构。,（3）反转重复（inverted repeated)：由反方向互补的两个DNA片段组成，两个反转重复序列又叫回文序列(palindrome sequence)。 （4）直接重复(direct repeat)：由同一方向完全

8、相同的两个序列组成。正向重复序列、顺向重复序列。,5 GGAATCGATCTTTTCTAGCTAAGG 3 3 CCTTAGCTAGAAAAGATCGATTCC 5,16,17,（5）DNA三股螺旋（triple strands DNA， H-DNA，ts-DNA）： 1957年由Felesnfeld及Davis首先发现。多聚嘧啶和多聚嘌呤组成的DNA螺旋区段，其序列中有较长的镜像重复时，形成局部三股配对，并互相盘绕的三股螺旋，其中两股的碱基按Watson-Crick方式配对，第三股多聚嘧啶（镜像重复）通过TAT和CGC配对，而处于双螺旋的大沟中。 三条链均为同型 嘌呤（Hpu）或同型嘧啶（H

9、py），有两种基本类型： Pu-Pu-Py型：在碱性介质中稳定。 Py-Pu-Py型：在偏酸性介质中稳定。 三链DNA既可以是B-DNA与另一条DNA链结合成的链间的三链DNA，又可以是B-DNA与其自身的一条链结合形成的链内的三链DNA。 分子内三链DNA于1987年由Mirkin在超螺旋中发现，其形成要求双螺旋中存在连续的嘌呤或嘧啶序列，而且必须是镜像重复序列。,18,19,（三）DNA的高级结构,1. 超螺旋（supercoil or superhelix ）结构 （1） 超螺旋的发现 1965年Vinograd等用电镜发现SV40和多瘤病毒的环形DNA的超螺旋；超螺旋是双螺旋DNA进一

10、步扭曲盘绕形成的高级结构。 a. 绝大多数原核生物DNA都是共价封闭环（covalently closed circle， CCC）分子， 双螺旋环状分子螺旋化成为超螺旋结构。 b. 有些单链环形染色体（如x174）或双链线形染色体（如噬菌体），在其生活周期的某一阶段，染色体也变为超螺旋结构。 c. 真核生物的染色体多为线形分子，但DNA均与蛋白质相结合，同样具有超螺旋形式。,20,21,（2）超螺旋的形成 DNA双螺旋结构中，一般每转一圈有10个核苷酸对，平时双螺旋总处于能量最低状态 ；若正常DNA双螺旋额外地多转或少转几圈，使每一圈的核苷酸数目大于或小于10，就会出现双螺旋空间结构的改变，

11、在DNA分子中产生额外张力；若此时双螺旋的末端是固定的或是环状分子，双链不能自由转动，额外的张力不能释放，导致DNA分子内部原子空位置的重排，造成扭曲，出现超螺旋。 （3）超螺旋的方向性 a. 正超螺旋：绳子的两股以右旋方向缠绕，如果在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。 b. 负超螺旋：如果在绳子一端向松缠方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋。,22,23,c. 松旋效应紧旋效应：形成超负螺旋时，旋转方向与DNA双螺旋方向相反，旋转

12、结果使DNA分子内部张力减小，称为松旋效应（在自然条件下共价封闭环状DNA呈负超螺旋结构 ）；与负超螺旋相反，形成正超螺旋时的旋转方向与DNA双螺旋方向相同，结果加大了DNA分子内部张力，具有紧旋效应。,（4）环绕数和超螺旋的关系 White在1969年建立了White方程来对超螺旋进行定量描叙，说明环绕数和超螺旋的关系。 L=T+W L（linking number）：链环数或称拓扑环绕数，指DNA中一条链绕另一条链的总次数。L是整数，在不发生链断裂时其值为常数，右手螺旋对L取正值。 T（twisting number）：缠绕数，即双螺旋的圈数。 T为变量，可以是非整数，右手螺旋时T为正值。

13、 W（writhing number）：扭曲数，即超数旋数。W为变量，可以是非整数，右手螺旋时，W取负值。,24,25,26,27,（5）DNA的超螺旋密度（） =（L-L0）/L0 L0是指松驰环形DNA的L值，天然DNA的超螺旋密度一般为-0.03-0.09，平均每100个螺旋出现3-9个负超螺旋。 a. 天然的DNA都呈负超螺旋，但体外可得到正超螺旋；由于双链DNA是动态变化的，其负超螺旋的链环数也会有所波动。 b. 负超螺旋会部分地转变为单链泡状结构，这种单链泡状结构也是解除松缠作用造成的胁变的一种途径；当然蛋白质会与这些单链泡状结构结合参与复制活转录；这也许就是为什么在生物内DNA总

14、是采取负超螺旋形式的主要原因。 c. 溴化乙锭（ethidium bromide）能与DNA紧密结合，使DNA的密度降低；它插入DNA分子碱基对之间，引起DNA分子松旋，随着EB量的增加，负超螺旋DNA就转变为松弛态；EB的进一步增加，DNA就转变为正超螺旋。,28,29,（6）不同类型DNA的高级结构及性质 a. 超螺旋使环状DNA分子变得更致密，在超速离心和在凝胶电泳中的迁移速度都增加;琼脂糖凝胶电泳可将超螺旋仅差一圈的DNA分离开。 b. 真核生物中，DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时，存在着负超螺旋。 c. DNA超螺旋是由DNA拓扑异构酶产生的。 d. 坍缩DNA：当闭合环超螺旋变

15、成闭合环松弛形DNA时，经碱变性或热变性使其氢键断裂，但两条链无法分离，结果生成两条链紧密缠结的分子；坍缩DNA具有很高的沉降常数，相对沉降常数约3.0（单链环状DNA的相对沉降常数大约为1.14；线性单链DNA的相对沉降常数为1.30）。 e. 环连DNA ：在DNA复制过程中的产物或由拓扑异构酶催化生成，由两个以上环形DNA分子环连而成。 f. 闭合环超螺旋DNA对于温度和碱性有较强的抵抗力，不容易发生变性；这样，可以寻找一个临界条件，使闭合环松弛形和开环松弛形DNA发生变性；而闭合环超螺旋不变性或很少变性。很多分离或鉴定闭合环超螺旋形DNA的方法都是依据其特性而设计的。,30,31,32

16、,（7）超螺旋的意义 a. 超螺旋形式是DNA分子复制和转录的需要： 生物体内DNA结构是处于动态之中，超螺旋的引入就提高了DNA的能量水平，而超螺旋程度的改变介导了DNA结构的变化，即超螺旋多余的能量可能使DNA双股链分开，或局部熔解，这种结构上的变化对DNA分子复制和转录等的启动很重要。 b. 超螺旋可使DNA分子形成高度致密的状态从而得以容纳于有限的空间。 如E.coli的DNA的总长度是其细胞长度的100倍， 由于它的DNA存在着超螺旋才能包装成类核（nucleoid）。 c. 染色体的形成过程：一级结构（核小体，直径10nm）、二级结构（螺线体，直径30nm）、三级结构（超螺线体，直

17、径400nm）、四级结构（染色体，直径1000nm），DNA双螺旋进一步扭曲盘旋所形成的特定空间结构。,33,34,35,第二节、RNA的组成与结构,一、 RNA的组成 RNA所含的戊糖为D-核糖，碱基为A、C、G、U。 二、RNA的基本结构 1RNA的一级结构：指RNA分子中4种核苷酸的连接方式和排列顺序。 2. RNA的分类及其二级结构 （1）mRNA：帽子结构和尾巴，5端，7-甲基鸟苷；3端， polyA 尾巴。 （2）rRNA：单链RNA自行盘绕形成局部双螺旋的多“茎”多“环”结构，螺旋部分称为“茎”或“臂”非螺旋部分称为“环”，在螺旋区，A与U配对，G与C配对。5SrRNA和16S

18、rRNA分别构成大亚基和小亚基。 （3）tRNA的二级结构： 三叶草形状可分为：氨基酸接受区、反密码区、二氢尿嘧啶区、TC区和可变区。除氨基酸接受区外，其余每个区都含有一个突环和一个臂。,36,3tRNA的三级结构：倒“L”形，所有的tRNA折叠后形成大小相似及三维构象相似的三级结构，这有利于携带的氨基酸的tRNA进入核糖体的特定部位。在翻译过程中转运各种氨基酸至核糖体，按mRNA的密码顺序合成蛋白质的作用。,37,三、mRNA的具体结构与功能,1. 原核生物mRNA结构特点： (1)多顺反子（polycistron）:一分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息，可以作为几种蛋白质的模板，能翻译出

19、几种蛋白质。 (2) mRNA5端无帽子结构，3 端一般无多聚A的尾巴。 (3)一般没有修饰碱基。,38,2. 真核生物mRNA结构的特点,（1）5 末端有帽子结构。 真核生物mRNA在转录后,在5端加上帽子(7甲基鸟嘌呤核苷)，在蛋白质翻译时识别起始位置及防止被RNA酶降解。,39,（2）3端多数带有多聚A的尾巴(polyadenylate tail)，其长度为20200个A. （3）分子中可能有修饰碱基，主要是甲基化。 （4）分子中有编码区与非编码区。 非编码区（untranslated region UTR）位于编码区的两端；5 非编码区有翻译起始信号。,40,四、tRNA：转运氨基酸,

20、1单链小分子，含7393个核苷酸； 2含有很多稀有碱基或修饰碱基，多为甲基化； 35 端总是磷酸化，且常是pG； 43 端为CCAOH； 5 二级结构为三叶草形；6三级结构为倒L型。,41,五、rRNA,核糖体的组成,42,rRNA二级结构 ： 单链RNA自行盘绕形成局部双螺旋的多“茎”多“环”结构，螺旋部分称为“茎”或“臂”非螺旋部分称为“环”，在螺旋区，A与U配对，G与C配对。,43,原核生物rRNA的特点 （）原核生物16SrRNA3 端有一保守序列ACCUCCU，是mRNA的识别结合位点。 （）原核生物5SrRNA4347位核苷酸为CGAAC序列，可与tRNA上GTCG互补。 真核生物

21、rRNA的特点 （）真核生物5.8SrRNA上也有相同的CGAAC序列,是tRNA与rRNA相互识别、相互作用的部位。 （）rRNA上有许多rRNA之间识别结合部位及蛋白质的相互作用部位。,44,原核生物70S核糖体,真核生物80S核糖体,核糖体的结构,45,六、核酶：有催化活性的RNA,核酶的发现 1982年，美国Thomas Cech 在研究四膜虫rRNA自我剪接时发现，同时加拿大的Sidney Altman 发现RNase P分子中的RNA组分有催化活性；1989年分享了Noble 化学奖。 核酶的发现意义 不仅拓宽了生物催化剂的领域，而且对RNA的生物学功能开创了一种历史性的新认识：R

22、NA不仅具有储存和传递遗传信息的功能，而且还具有生物催化剂的功能，在一定程度上可以说，RNA一身兼有DNA和蛋白质两大类生物大分子的功能。,46,核酶的二级结构 核酶的二级结构对于催化活性很重要。Symons提出“锤头”状二级结构，三个螺旋区，13（或11）个保守核苷酸序列。,47,七、核内不均一RNA（hnRNA） 真核细胞转录生成mRNA的前体；加工过程包括：5加帽；3端加尾；内含子的切除和外显子的拼接；分子内部的甲基化修饰作用；核苷酸序列的编辑作用。 八、小分子核内RNA（snRNA） 真核细胞核内一组小分子RNA，含70300碱基,序列中尿嘧啶含量较高，因此又用U命名。既非任何RNA的

23、前体，也非某种RNA代谢的中间产物，而是具有独特功能且独立存在的实体，参与mRNA的加工。常与多种特异的蛋白质结合在一起，形成小分子核内核蛋白颗粒（small nuclear ribonucleoprotein particle，snRNP）,48,九、反义RNA,碱基序列正好与有意义mRNA互补的RNA，又称为调节RNA。 可与mRNA配对结合形成双链，最终抑制mRNA作为模板进行翻译。 还可作为DNA复制的抑制因子，与引物RNA互补结合抑制DNA复制，及在转录水平上与mRNA5端互补，阻止RNA合成转录。 可以人工合成反义RNA来调节基因的表达，用于疾病治疗。 原核生物中也有一种mRNA干

24、扰互补RNA（Mrna interfering complementary RNA，micRNA），也可与特异mRNA结合并阻止翻译。,49,十、核酸的提取,核酸的酚抽提 （）原理：交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。 （）氯仿还可加速有机相与水相的分层。 （）异戊醇：抑制界面泡沫的形成。 （）标准程序：酚酚-氯仿氯仿。 核酸的沉淀 （）原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性。 （）醋酸钠为沉淀DNA、RNA的最常用盐类。 （）有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。 （）温度：冰水。,50,真核细胞RNA的提取纯化 （）注意事项 一个典型的哺乳动物细胞约含1

25、0-5gRNA，其中8085%为rRNA，mRNA为细胞总RNA的15%。制备高质量真核细胞RNA的关键是在抽提的最初步骤就需要抑制核糖核酸酶的活性，并避免所用玻璃器皿及液体污染微量核糖核酸酸酶。 （）创造一个无RNA酶的环境 洁净实验室环境，一次性手套，环境洁净（避免飞尘中细菌真菌产生外源性RNA酶污染），玻璃和塑料器皿处理（ 玻璃：常规洗净后，200干烤4小时；塑料：一次性）。 （）溶液配制： 加0.1%DEPC371216h，高压除去残留的DEPC。不能高压灭菌的溶液，用DEPC处理过的无RNA酶的三蒸水配制，用滤膜过滤除菌。 DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但并不彻底的RNA酶抑制剂，通过和RNA酶中His结合使蛋白质变性，抑制RNA酶活性。C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5,51,（）抑制内源性RNA酶酶活 异硫氰酸胍：强烈变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，使RNA从细胞中释放，又称解偶剂。-巯基乙醇和异硫氰酸胍能使细胞内各种RNA酶失活。 十二烷基肌酸钠：可使核糖体蛋白质与RNA分子分离。 Rnasin：核糖核酸酶素，是RNA酶的一种非竞争性抑制剂 。,52,思考题,1. 叙述DNA的组成与结构特点。 2. 叙述RNA种类及其组成结构。 3. 简核酸提取与纯化方法及其注意事项。,