分子生物学第二章DNA结构与复制.ppt

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1、2.2 DNA2.2 DNA的结构的结构 核酸的结构及其功能 DNA-遗传的物质基础，基因是具有特定生 物功能的核苷酸序列，基因通过转录和翻译 能够使亲代的性状准确地在子代表现出来。 DNA的此种功能与其分子结构是密切相关。 2.2.1 DNA2.2.1 DNA的一级结构的一级结构 1.DNA1.DNA的化学成分的化学成分 2.DNA2.DNA和和RNARNA化学成分的比较化学成分的比较 3. 3. 核苷酸的结构核苷酸的结构 4. DNA4. DNA的一级结构的一级结构 （1 1）DNADNA一级结构的表示法一级结构的表示法 （2 2）DNADNA碱基组成的碱基组成的ChargaffCharg

2、aff规则（规则（19491949） （3 3）DNADNA和和RNARNA一级结构的比较一级结构的比较 2.2.2 DNA2.2.2 DNA的二级结构的二级结构 DNA DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行 盘绕所形成的双螺旋结构。盘绕所形成的双螺旋结构。 在在DNADNA二级结构与二级结构与 高级结构间或高级结高级结构间或高级结 构的各种构象间存在构的各种构象间存在 一个动力学平衡。一个动力学平衡。 Z-DNAZ-DNA调控基因转录的两个模式调控基因转录的两个模式 DNADNA的双螺旋结构的意义的双螺旋结构的意义 该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳

3、定性特征，最 有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转 录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的 分子基础。 2.3 DNA的复制 研究证明生命的遗传实际上是染色体DNA自我复制的结 果。而DNA自我复制主要是通过半保留复制来实现的，是一 个以亲代DNA分子为模板合成子代DNA链的过程。即细胞分 裂时，通过DNA自我复制将亲代细胞所含有遗传信息传递到 子代细胞。 双链DNA的复制包括 复制的起始、延伸和终止三个阶段 ，并需要拓扑异构酶、解链酶、单链结合蛋白、引物合成酶 、DNA聚合酶及DNA连接酶等酶和蛋白质的参与。 2.3.1 DNA2.3.1 DNA的半保留复制的半保留复制

4、Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型的同时对其复制 过程进行了探讨。 DNA在复制过程中碱基间的氢键首先断开，每条链分别作 为模板合成新链，产生互补的两条链。 新合成2条DNA链的核苷酸序列和亲代DNA链完全相同。 因此，每子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合 成的，DNA这种复制方式叫做DNA的半保留复制。 氯化铯密度梯度离心法： 由于15N-DNA分子的密度比普通DNA的密度大，在氯化铯密 度梯度离心时，这两种DNA分子形成位置不同的区带。 结果证实：无论原核还是真核生物DNA都是以半保留复制方式遗传的 2.3.2 2.3.2 复制的起点、方向和速度复制的起点、方向

5、和速度 DNA复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行，所以， 这个复制起始点呈现叉子的形式，被称为复制叉。DNA的复 制是由固定的起始位点开始的。 复 制 子是生物体DNA复制的基本单位，一个复制子只含 一个复制起始位点。 复制叉从复制起点开始沿着DNA链连续移动，起始点可以 启动单向复制或者双向复制，这主要取决于在复制起点形成一 个还是两个复制叉。 复制起始点的特点复制起始点的特点 1.富含AT：测定细菌、酵母、线粒体和叶绿体DNA中的复 制起始点核苷酸序列，发现复制起始点富含AT序列，它可能 有利于DNA复制启动时双链的解开。 2. 细菌、病毒和线粒体DNA分子只有一个复制起始点，即 只

6、有一个复制子。 3. 真生物基因组DNA有多个复制起点，可以同时在多个复 制起点上进行双向复制，其大小为40-100kb/个。 复制叉移动方向复制叉移动方向 放射性自显影法：对于大基因组内的 不确定区域，两次连续的放射脉冲可以 用来标记复制的移动。如果一个脉冲比 另一个脉冲强，我们可以用相对的标记 强度来区分，这些可用放射自显影观察 。 单向复制：在复制眼的一端，一种类型 的标记后紧跟着另一种标记； 双向复制：在复制眼的两端产生一种（ 对称的）模式。在真核生物中普遍存在 。 DNADNA链复制过程示意图链复制过程示意图 2.2.3 DNA2.2.3 DNA复制的几种主要方式复制的几种主要方式

7、生物体内DNA双链的复制大都是以半保留方式 进行的；但是不同生物DNA分子存在形式各不相同 ，如大小、线性分子、环状分子、功能差异，因而 反映在复制方式上的差异。绝大多数DNA复制是以 复制叉的形式进行的。 线性DNA双链的复制 研究表明DNA聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从5端向 3端移动；体内DNA复制时，由一段RNA引物起始DNA合成 ，起始后RNA引物被切除，使子链短于母链。切除后的5端 缺口如何合成？这就提出了线性DNA末端复制的问题。 寿命缩短？ 线性DNA末端复制的特殊机制 （1）线性复制子转变为环状或多聚分子：T4噬菌体DNA通过 其末端的简并性使不同链的3端因互补而结合。DN

8、A聚合酶作 用填满其缺口，再经DNA连接酶作用生成二联体。 （2）DNA末端形成发夹式结构，是该分子没有游离的末端。 如草履虫线粒体DNA。 （3 3）某种蛋白启动复制）某种蛋白启动复制 腺病毒腺病毒DNADNA分别在分子两端分别在分子两端 启动复制，并通过链取代法使之启动复制，并通过链取代法使之 延伸。延伸。 末端蛋白的作用下，在真正的末端蛋白的作用下，在真正的 末端上启动复制。末端上启动复制。 （1）-复制 （2）滚环复制 （3）D-环复制 2.环状DNA的复制 （1）-复制 E.coli基因组的复制原点位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操纵子之间， 全长=45 bp，称为oriC。OriC富含

9、AT，并含有多个短的重复序列，能够 被复制起始点结合蛋白所识别。复制的起始： 涉及DNA双链的解旋和松 开，形成两个方向相反的复制叉。前导链还是复制前，复制原点的核酸 序列被转录生成短的RNA链，作为起始DNA复制的引物。 （2）滚环复制（replication by rolling cycles structure） 这是单向复制的一种特殊形式。X174噬菌体由一个单链环 状DNA组成，这条链称为正（+）链；合成的互补链称为负（- ）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。 (3)D-环型（D-loop）： 这也是一种单向复制的特殊方式。这种方式首先在动物线粒体DNA的 复制中被发现。双链环在固

10、定点解开进行复制。但两条链的合成是高度 不对称的，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的单链环 （即D-环）。 2.4 DNA2.4 DNA复制的特点复制的特点 2.4.1 2.4.1 原核生物原核生物E. coliE. coli DNADNA复制的特点复制的特点 基因组DNA是双链环状；复制起始区位于其遗传图的84min附近；OriC 含有3个13bp和4个9bp的两个保守序列。复制起始后形成的两个复制叉沿着 整个基因组双向等速移动，DNA复制中间产物呈一个。 1. DNA1. DNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋 研究证实多种蛋白质及酶参与DNA双链的解开过程。如拓 扑异构酶I、DNA解

11、链酶及SSB蛋白等。 （1 1）DNADNA解链酶解链酶 DNA helicase是经水解ATP获得能量来解开双链DNA， 大部分DNA helicase沿着随后链模板5 3方向及沿着复制叉 的前进而移动。 研究证明：Rep蛋白和特定的DNA解链酶分别在DNA两条链 上协调作用，以解开双链DNA。 （2 2）单链结合蛋白）单链结合蛋白(SSB(SSB蛋白）蛋白） 发现噬菌体T4的基因32蛋白可以在远低于解链温度时使 双链DNA分开，并牢牢地结合在单链DNA上，后来发现许多 生物中都有这类蛋白。 原核生物：SSB蛋白与DNA结合时还表现协同效应，如第 1个SSB蛋白结合DNA的能力为1，第2个S

12、SB蛋白的结合力可 达103。真核生物SSB蛋白与单链DNA结合时，不表现协同效 应。 SSB蛋白: 保证被解链酶解开的ssDNA在复制完成之前能 保持单链结构，SSB蛋白以四聚体形式存在于复制叉处，他 没有解链作用。 （3 3）DNADNA拓扑异构酶（拓扑异构酶（DNA topoisomeraseDNA topoisomerase） DNA复制过程中，随着DNA解旋，双螺旋的盘绕数T减 少，而超螺旋数W增加，使正超螺旋增加，未解链部分的缠 绕更加紧密，形成的压力使解链不能继续进行。 DNA拓扑异构酶作用 它能够消除解链造成的正超螺旋堆积，消除阻碍解链继 续进行的此种压力，使DNA复制得以延伸

13、。 2.DNA2.DNA复制的引发复制的引发 研究发现： 所有DNA复制是由一个固定的起始位点开始； DNA聚合酶都只能延长已存在的DNA链，而不能从头 合成DNA链。 问题：一个新链DNA的复制怎样开始的呢？ 研究发现：研究发现：所有DNA聚合酶都从脱氧核苷酸3-OH端起始DNA合 成，所以，DNA复制时，由引发酶(特殊RNA聚合酶)在DNA模 板上合成一段RNA链，它提供引发末端（引物），接着由DNA 聚合酶从RNA引物的3-OH端开始合成新的DNA链。无论前导链 还是后随链开始DNA合成时，都需要RNA引物。 参与参与DNADNA复制的蛋白质：复制的蛋白质： 后随链的引发由引发体来完成。

14、引发体由后随链的引发由引发体来完成。引发体由n n，n n ，n n，DnaBDnaB 、C C和和I I等等6 6种蛋白质共同组成。种蛋白质共同组成。 DnaADnaA：结合：结合OriOri区，具区，具ATPATP酶活性，促进酶活性，促进DnaBDnaB形成起始复合物形成起始复合物 DnaBDnaB：DNADNA解链酶，有解旋和解链作用解链酶，有解旋和解链作用 DnaCDnaC：形成起始复合物，运输：形成起始复合物，运输DnaBDnaB DnaGDnaG：DNADNA引发酶由引发酶由dnaGdnaG基因编码，在特定环境下发挥作用基因编码，在特定环境下发挥作用 的的RNARNA聚合酶聚合酶

15、HuHu： 促进起始复合物形成促进起始复合物形成 回旋酶：松驰正超螺旋，促进单链回旋酶：松驰正超螺旋，促进单链DANDAN产生产生 SSBSSB： 促进促进DNADNA解链，稳定单链解链，稳定单链DNADNA 性 3. 3.冈崎片段与半不连续复制冈崎片段与半不连续复制 dsDNA两条链是反向平行的，因此在复制叉附近的DNA 链一条是53，另一条是3 5，即两条模板极性不同。 而DNA聚合酶：DNA合成方向是53，而不是3 5。 无法解释DNA两条链是如何能够同时进行复制？ 日本科学家Okazaki通过含3H-dTTP 培养基培养大肠菌标 记其DNA，提出DNA的半不连续复制模型。 原核生物冈崎

16、片段 真核生物冈崎片段 Okazaki fragment：10002000b。 冈崎片段与DNA的半不连续复制模型 前导链连续复制，而后随链不连续复制。 4. 4. 复制的终止复制的终止 Tus蛋白参与DNA复制的终止，而不需要太多蛋白质的参 与。终止子序列由22个碱基的重复序列的Ter组成。当复制叉 迁移到Ter时，Ter-Tus复合物能使DnaB不能再将DNA解链， 阻挡复制叉的继续迁移，而为复制的50-100bp经修复方式填补 。拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。 5. DNA聚合酶 (1) 大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能 Klenow 片段: This enzym

17、e is purified from E. coli cells in which the 3- end two-thirds of the E. coli DNA polymerase I gene is cloned. Thus, it has 35exonuclease activity, but not 53exonuclease activity. 68 kD 35 kD DNA聚合酶 其有53聚合酶活性，但活性低，其酶活性是DNA聚合 酶的5%。 通过其3 5 核酸外切酶活性可起校正作用。 DNA聚合酶 其有53聚合酶活性，3 5 核酸外切酶活性。该酶活 性为DNA聚合酶的15倍，

18、 DNA聚合酶的300倍。 即5万个核苷酸/min速度合成新DNA链。 其他DNA聚合酶 DNA聚合酶和分别由dinB和umuD 2C基因编码，主要 在SOS修复过程中发挥作用。 2.4.2 真核生物DNA复制的特点 （1）DNA分子上出现多复制起始位点； （2）真核生物染色体在全部完成复制前，各个起始点上 DNA复制不能再开始； （3）真核生物DNA复制只在其细胞周期S期进行； （4）真核生物复制子大小约为40100kb。 真核生物DNA复合起始区特点： 酵母复制起始区长度约为150bp，包括数个复制起始必须 的保守区， 将克隆该DNA片段构建环状DNA分子，它在酵母 中自主复制的。 酵母复

19、制起始位点成为自主复制序列(autonomously replicating sequences, ARS）。不同ARS共同特征是具有一个 11个A-T碱基对的保守序列。 ORC（origin recognition complex）识别并结合ARS序列 ，ORC有6种蛋白组成的起动复合物。 人类基因组DNA上每隔30000300 000bp序列有一个复制 起始位点。真核生物DNA复制叉的移动速度为50bp/sec， E.coli的1/20。 真核生物DNA聚合酶 哺乳动物主要有5种DNA聚合酶，其特性见表2-12. 2.4.3 DNA2.4.3 DNA复制的调控复制的调控 1. 1.大肠杆菌

20、基因组大肠杆菌基因组DNADNA的复制调控的复制调控 v原核细胞的生长和增殖速度取决于培养条件，但在生长增殖 速度不同的细胞中DNA链延伸的速度几乎是恒定的，只是复 制叉的数量不同。 v细胞内复制叉的多少决定了复制起始频率的高低，这可能是 原核细胞复制的调控机制。复制起始频率的直接调控因子是 蛋白质和RNA。 v大肠杆菌染色体DNA复制调控 染色体的复制与细胞分裂一般是同步的，但复制与细胞分裂 不直接耦联。复制起始不依赖于细胞分裂，而复制的终止则 能引发细胞分裂。 v复制子与转录的操纵子相似，由起始物位点和复制起点两部 分组成。起始物位点编码复制调节蛋白质，复制起点与调节 蛋白质相互作用并启动

21、复制。起始物位点突变使复制停止并 导致细胞死亡。 v大肠杆菌的复制起点有OriC和OriH两种，其中OriC是首选 的复制起点，而OriH是在RNaseH缺失突变株中发现的一系 列复制起点。 调控主要表现在复制的起始水平上 E.coli 细胞分裂周期 依营养条件变化 DNA复制周期基本保持30-40min/cycle 37 葡萄糖（C源） 45 min/cell cycle 琥珀酸（C源） 70 min/cell cycle C starved 10 hrs/cell cycle C suffice 21 min/cell cycle But DNA replication 40min mor

22、e or less by premature initiation 2 2、ColE1ColE1质粒质粒DNADNA复制调控复制调控 ColE1质粒：6646 bp的小质粒 拷 贝 数：2030/cell ColE1质粒：不依赖于其本身编码的蛋白质，而完全依靠宿 主DNA聚合酶I 质粒编码：两个负调控因子Rop蛋白和反义RNA（RNA1） ，Rop蛋白和RNA1控制DNA合成所需的引物。 RNA1通过与引物RNA前体互补作用，阻止RNaseH加工引物前体 ，使其不能转化为有活性的引物，而对DNA复制起负调控作用。 Rop蛋白能提高RNA1与引物前体的互补，增强了RNA1的负调控 作用。 pri

23、mer（555nts ） 3. 3. 真核细胞真核细胞DNA DNA的复制调控的复制调控 v真核细胞的生活周期包括G1、S、G2和M等4个期。 vG1:复制预备期，S:复制期，G2:有丝分裂准备期，M:有丝分 裂期。 vDNA复制只发生在S期。 v真核生物DNA复制有3个水平的调控： (1)细胞生活周期水平调控 决定细胞停留在G1期还是进入S期。许多外部因素和细胞因 子参与限制调控。 如促细胞分裂剂、致癌剂、外科切除等都可以诱导细胞由 G1期进入S期。 (2)染色体水平调控 决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一 定顺序在S期起始复制，这种有序复制机制还不清楚？ （3）复制子水平调控

24、决定复制的起始与否。这种调控从单细胞生物到高等 生物是高度保守的。 此外，真核生物复制起始还包括转录活化、复制起始 复合物的合成和引物合成等阶段。许多参与复制起始蛋白 的功能与原核生物中相类似 2.5 DNA的修复 一个物种能够一代一代地遗传下去，是因为DNA能够稳定复 制。如果DNA不能稳定地复制，那么，物种就不存在了。但， 在进化过程中，受到各种因素的影响，导致DNA复制的差错或 碱基突变，使生物具有多样性。 DNA复制过程中，发生的差错，可以引起突变。同时，还会 受到一些化学反应、物理反应、生物反应造成DNA分子损伤， 引起DNA突变。 DNADNA突变的主要因素突变的主要因素 碱基脱落

25、碱基脱落: : 形成形成APAP位点；碱基的改变位点；碱基的改变; ; 电离辐射等物理因素电离辐射等物理因素 ；硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯等化学因素；：；硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯等化学因素；：DNADNA病毒和病毒和RNARNA 病毒感染、质粒转移、基因重组、转座子的转位等生物因素均病毒感染、质粒转移、基因重组、转座子的转位等生物因素均 能使能使DNADNA发生突变。发生突变。 1. 错配修复 经错配修复系统识别新合成链中的错配并加以校正。 （1）发现碱基错配; （2）在水解ATP作用下, MutS、MutL与碱基错配位点 的DNA双链结合；（3）MutS-MutL在DNA双链上移动，发现甲基化

26、DNA后 由MutH切开非甲基化的子链。 2. 2. 切除修复切除修复 （1 1）碱基切除修复）碱基切除修复 研究发现，所有细胞中都有不同类型 的能识别受损伤核苷酸位点的糖苷水解酶 ，它能特异性切除受损核苷酸上的N-糖 苷键，在DNA上形成去嘌呤或去嘧啶位点 ，成为AP位点。 DNA糖苷水解酶具有特异性，如尿嘧 啶核苷水解酶能特意性识别DNA链中胞嘧 啶自发脱氨形成的尿嘧啶。 AP核酸内切酶能切开损伤核苷酸的糖 苷-磷酸键，移去包括AP位点核苷酸在内 的DNA小片段，DNApolyI合成新的片段 ，DNA连接酶连接。 脱氨基反应 脱氨基反 应 （2 2）核苷酸切除修复）核苷酸切除修复 DNA切

27、割酶 3. 3. 重组修复或复制后修复重组修复或复制后修复 机体细胞对在复制起始时尚未修复的DNA损伤部位可以先复 制再修复，即先跳过该损伤部位，在新合成链中留下一个对应 于损伤序列的缺口。 4. DNA4. DNA的直接修复的直接修复 将损伤的碱基回复到原状态的 一种修复系统。 DNA光解酶将在紫外线照射形 成的环丁烷胸腺嘧啶二体及6-4 光化物还原成为单体的过程。 O6-甲基转移酶从O6-甲基鸟嘌 呤核苷酸中移去甲基，以防止形 成G-T的配对。 5. SOS5. SOS修复修复 SOSSOS反应是国际上通用的反应是国际上通用的紧急呼救信号紧急呼救信号。SOSSOS修复是指修复是指DNADN

28、A 受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNADNA修复方修复方 式，修复结果只是能维持基因组的完整性式，修复结果只是能维持基因组的完整性 。 SOS SOS修复是在修复是在DNADNA分子受到重大损伤时诱导产生的一种应急分子受到重大损伤时诱导产生的一种应急 反应，它使细胞内源修复酶合成量增加，甚至产生新的修复酶反应，它使细胞内源修复酶合成量增加，甚至产生新的修复酶 来修复损伤的来修复损伤的DNADNA。 LexALexA蛋白是一种阻遏蛋白，在正常情况下，阻遏蛋白是一种阻遏蛋白，在正常情况下，阻遏SOSSOS系统系统 各种基因的大量表达。各种

29、基因的大量表达。 在正常情况下，在正常情况下，umuCumuC和和umuDumuD基因被基因被LexALexA阻遏。当阻遏。当DNADNA受损时，受损时， LexALexA子体切割后，解除阻遏作用。子体切割后，解除阻遏作用。umuCumuC和和umuDumuD基因表达。基因表达。 当当RecARecA结合并促进结合并促进LexALexA自体切割时，也促进自体切割时，也促进umuDumuD的子体切割，称为的子体切割，称为 umuDumuD子切体。随后，子切体。随后，umuCumuC和和umuDumuD蛋白帮助蛋白帮助DNApolDNApol跨过损伤而完跨过损伤而完 成染色体成染色体DNADNA的复制和细胞分裂。的复制和细胞分裂。