分子生物学第六章基因的表达与调控上 (2).ppt

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1、 6 基因的表达与调控(上) 原核基因表达调控模式 v 原核生物细胞: v v 基因和蛋白质种类较少 v v 如大肠杆菌基因组约为4.60x106bp共有4288个 可读框。 v 据估计，一个细胞中总共含有107个蛋白质分 子，如果每个基因等同翻译的话，任何一个多肽应 有2500个拷贝。 v 但是，这些蛋白质并不是以相同拷贝数存在于 每个细胞中的，有些蛋白质的数目相当固定，另一 些则变化很大。 v 每个大肠杆菌细胞可以有约15000个核糖体，与 其结合的约50种核糖体蛋白，数量也是十分稳定的 。糖酵解体系的酶含量很大，其数目也极恒定。 v 如DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代谢过程 中十分必需

2、的酶或蛋白质，其合成速率不受 环境变化或代谢状态的影响，这一类蛋白质 被称为组成型(constitutive)合成蛋白质。 v 另一种类型的蛋白质的合成速率 明显地受环境的影响而改变，被称为 适应型或调节型（adaptive or regulated)蛋白质。 v 一般情况下，一个大肠杆菌细胞中只有 15个分子的-半乳糖苷酶，但若将细胞培养 在只含乳糖的培养基中，每细胞中这个酶的 量可高达几万个分子。 v 其他参与糖代谢的酶，氨基酸、核苷酸 合成系统的酶类，其合成速度和总量都随培 养条件的变化而改变。 v 细菌中所利用的大多数基本调控机制一般执行 如下规律： v 一个体系在需要时被打开，不需要

3、时被关闭。 是通过调节转录来建立的，也就是说在mRNA的合成 水平上调节。 v 实际上，当我们说一个系统处于关闭状态时， 也可能有本底水平的基因表达，常常是每世代每个 细胞只合成1或2个mRNA分子和极少量的蛋白质分子 。表示是基因表达量特别低，很难甚至无法检测。 61 原核基因表达调控总论 v 基因表达： v 从DNA到蛋白质的过程称为基因表达(gene expression） v 对这个过程的调节就称为基因表达调控(gene regulation或gene control)。 vv rRNArRNA、tRNAtRNA编码基因转录合成编码基因转录合成RNARNA的过程也属于的过程也属于 基因

4、表达。基因表达。 v 基因调控是现阶段分子生物学研究的中心课题。 组成性表达(constitutive expression) 适应性表达(adaptive expression） 基因表达的方式 1、组成性表达： 指不大受环境变动而变化的一类基因表达。 某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达 ，通常被称为管家基因(housekeeping gene)。 2、适应性表达 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表 达。 v 应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导 (induction)，这类基因被称为可诱导的基因(inducible gene)； v 相反，随环境条件变化而基因表达

5、水平降低的现象 称为阻遏(repression)，相应的基因被称为可阻遏的基因 (repressible gene)。 基因表达的规律 时间性和空间性 1、时间特异性（temporal specificity） 按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定 的时间顺序发生，称之为基因表达的时间特异性。 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特 异性(stage specificity)。 2、空间特异性(spatial specificity) 基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布 差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所 以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue spe

6、cificity)。 在个体生长全过程，某种基因产物在个体按 不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间 特异性。 基因表达调控的生物学意义 v 适应环境、维持生长和增殖（原核、真核） 维持个体发育与分化（真核） v基因表达调控主要表现： v (1)转录水平上的调控 v (transcriptional regulation)； v (2)转录后水平上的调控 v (post transcriptional regulation) v转录后水平上的调控包括: v mRNA加工成熟水平上的调控 v (differential processing of RNA transcript)； v 翻译水

7、平上的调控 v (differential translation of mRNA)。 v原核生物中 v 营养状况(nutritional status) v 环境因素(environmental factor) v 对基因表达起着举足轻重的影响。 v真核生物尤其是高等真核生物中 v 激素水平(hormone level) v 发育阶段(developmental stage) v 是基因表达调控的最主要手段，营养和 环境因素的影响力大为下降。 v原核: v 转录与翻译 过程几乎发生在同一 时间间隔内，转录与 翻译相偶联。 v真核生物: v 转录产物只有从 核内运转到核外，才 能被核糖体翻译成

8、蛋 白质。 6.1.1 原核基因调控机制的类型与特点 v原核生物的基因调控主要发生在转录水平上。 v根据调控机制的不同可分为： v 负转录调控(negative transcription regulation) v 正转录调控(positive transcription regulation) v 在负转录调控系统中，调节基因的产物是 阻遏蛋白(repressor)，起着阻止结构基因转录 的作用。 v 根据其作用特征又可分为: v 负控诱导 v 负控阻遏 v 二大类。 v 在负控诱导系统中 ，阻遏蛋白不与效应物 (诱导物)结合时，结构 基因不转录； v 在负控阻遏系统中 ，阻遏蛋白与效应物

9、结 合时，结构基因不转录 。 v 阻遏蛋白作用的部 位是操纵区。 v 在正转录调控系统中，调节基因的产物 是激活蛋白(activator)。 v根据激活蛋白的作用性质分为: v 正控诱导系统 v 正控阻遏系统。 v 在正控诱导系统 中，效应物分子(诱导 物)的存在使激活蛋白 处于活性状态； v 在正控阻遏系统 中，效应物分子的存 在使激活蛋白处于非 活性状态。 转录水平上调控的其他形式 1. 因子的更换 在E.coli中,当细胞从基本的转录机制转 入各种特定基因表达时，需要不同的因子指 导RNA聚合酶与各种启动子结合。 参与大肠杆菌基因表达调控最常见的蛋白质是 因子。 v温度较高,诱导产生各种

10、热休克蛋白 由32参与构成的RNA聚合酶与热休克应答基因 启动子结合,诱导产生大量的热休克蛋白,适应环境 需要 枯草芽孢杆菌芽孢形成 有序的因子的替换,RNA聚合酶识别不同基因 的启动子,使芽孢形成有关的基因有序地表达 v 除参与氮代谢的 54以外，其它5种 因子在结构上具有同源 性，所以统称70家族 。 v 所有因子都含有 4个保守区，其中第2个 和第4个保守区参与结 合启动区DNA，第2个保 守区的另一部分还参与 双链DNA解开成单链的 过程。 v 大多数因子特异性结合DNA上的-35区和-10区，而54 因子识别并与DNA上的-24和-12区相结合。 v在与启动子结合的顺序上: v 70

11、类启动子在核心酶结合到DNA链上之后才能与启动子 区相结合 v 54则类似于真核生物的TATA区结合蛋白(TBP)，可以在 无核心酶时独立结合到启动子上。 v 通过特殊代谢物调节的基因活性主 要有两大类： v 可诱导 v 可阻遏 v (1)可诱导调节： v 是指一些基因在特殊的代谢物或化合 物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作 状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。 v 大肠杆菌在含有葡萄糖的培养基中生长良好， 在只含乳糖的培养基中开始时生长不好，直到合成 了利用乳糖的一系列酶，具备了利用乳糖作为碳源 的能力才开始生长。 v 细菌在诱导物乳糖的诱导下开动了乳糖操纵子 ，表达它所编码的3个酶：

12、 v -半乳糖苷酶(使乳糖水解为半乳糖和葡萄糖) v -半乳糖苷透过酶(使乳糖进入细菌细胞内) v -半乳糖苷乙酰基转移酶(使-半乳糖第六位碳原子 乙酰化)。 v 在葡萄糖培养基中生长时，每个细胞只有几个 -半乳糖苷酶分子，但若转移到乳糖培养基中，几 分钟后，每个细菌细胞内可产生3000个酶分子。 v 因此，这类基因被称为可诱导基因 v 这类酶被称为诱导酶 v 这个生化过程被称为酶的诱导合成。 v (2)可阻遏调节： v 这类基因平时都是开启的，处在产生蛋 白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢 物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因 的表达。 v 大肠杆菌生活中必须有色氨酸，一般情况下， 色

13、氨酸操纵子是开启的。 v 如果在细菌培养基中加入色氨酸，使之能利用 培养基中的色氨酸来维持生活而不需要再费力去合 成，细菌往往能在2-3 min内完全关闭该操纵子。 v 某一代谢途径最终产物合成酶的基因可以 被这个产物本身所关闭。 v 这种基因被称为可阻遏基因 v 这些酶被称为可阻遏酶 v 这个现象被称为可阻遏现象 v 这些起阻遏作用的小分子被称为阻遏物。 v一般规律： v 可诱导的操纵子总是一些编码糖和氨基酸分解代谢 蛋白的基因，这些糖和氨基酸平时含量很少，细菌总是 利用更一般的能源物质葡萄糖的水解来提供能源， 因此，这些操纵子常常是关闭的。 v 一旦生存条件发生变化，如葡萄糖缺乏而必须利用

14、 乳糖作为能源时，就要打开这些基因。 v 可阻遏基因是一些合成各种细胞代谢过程中所 必须的小分子物质(如氨基酸、嘌呤和嘧啶等)的基 因，由于这类物质在生命过程中的重要地位，这些 基因总是打开着的。 v 只有当细菌生活环境中有充分供应时，才关闭 这些基因，停止其合成。 612 弱化子对基因活性的影响 v 大肠杆菌中色氨酸操纵子、苯丙氨酸操 纵子等的调节方式是通过弱化子调节的。 v 在这种调节方式中，起信号作用的是有特 殊负载的氨酰-tRNA的浓度，在色氨酸操纵子 中就是色氨酰-tRNA的浓度。 v 当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时。 v 起终止转录信号作用的那一段核苷酸被称 为弱化子。 v 因

15、为核糖体在基因转录产物上的不同位置，决 定了RNA可以形成哪一种形式的二级结构、并由此 决定基因能否继续转录。 v 起调节作用的信号分子是细胞中某一氨基酸或 嘧啶的浓度，因此是转录调节中的微调整，只要稍 加变动就可影响整个体系的功能。 v 属于这种调节方式的有: v 大肠杆菌中的色氨酸操纵子 v 苯丙氨酸操纵子 v 苏氨酸操纵子 v 异亮氨酸操纵子 v 缬氨酸操纵子 v 沙门氏菌的组氨酸操纵子和亮氨酸操纵子 、嘧啶合成操纵子等。 613 降解物对基因活性的调节 v 操纵子学说的核心是使基因从表达抑制状态中 解脱出来进行转录，是从负调节的角度来考虑基因 表达调控的。 v 如何通过正调节以提高基因

16、的转录水平，使它 由原来的低水平表达变成高水平表达，这就是降解 物抑制作用的调节。 v 有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中 加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物， 与其相对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢 这些糖的酶来，这种现象称为葡萄糖效应或称为降 解物抑制作用。 因为添加葡萄糖后，细菌所需要的能量便可从 葡萄糖得到满足，细菌无需开动一些不常用的基因 去利用那些稀有的糖类。 v 葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶活 性，减少cAMP的合成 v 与它相结合的蛋白质环腺苷酸受体蛋白 CRP（又称分解代谢物激活蛋白CAP）因找不到配 体而不能形成复合物。 v 降解物抑制作用是通过

17、提高转录强度来调节 基因表达的，是一种积极的调节方式。 614 细菌的应急反应 v 在所谓“正常”，也包括生活环境中缺少某一种或两种 能源，细菌能找到其他代用物，进行正常生活条件下的基因 表达调节。 v 可是，细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿时， 就不是缺少一二种氨基酸，而是氨基酸的全面匮乏。为了紧 缩开支，渡过难关，细菌将会产生一个应急反应，包括生产 各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过 程均被停止。 v 实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五 磷酸(pppGpp)。 v 产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。 v 当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量

18、的不带氨 基酸的tRNA，这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶 ，使ppGpp大量合成，其浓度可增加10倍以上。 v ppGpp的出现会关闭许多基因，当然也会打开一 些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急状况。 v 关于ppGpp的作用原理还不大清楚。 v 一般认为RNA聚合酶有不同的构象，这些构象可以 识别不同的启动子区，ppGpp与RNA聚合酶结合会使它的 某些构象稳定下来，从而改变了基因转录的效率。 v 也有人认为基因转录起始位点附近有一些保守序列 ，它们可能是ppGpp或有关调节蛋白的结合位点。当这 些序列与ppGpp结合后，就不能与RNA聚合酶相结合，使 基因被关闭。 v ppGpp与p

19、ppGpp的作用范围十分广泛，它们不是只 影响一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以它们是 超级调控因子。 1、操纵子模型的提出 1961年，Monod和Jacob提出 获1965年诺贝尔生理学和医学奖 62 乳糖操纵子与负控诱导系统 Jacob and Monod 2、操纵子的定义 操纵子： 是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基 因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组 成。 操纵基因受调节基因产物的控制。 v 大肠杆菌乳糖操纵子包括3个结构基因：Z、Y 和A，以及启动子、控制子（基因）和阻遏子等。 v 转录时，RNA聚合酶首先与启动区(promoter， P)结合，通过操纵区(oper

20、ator，O)向右转录。 v 转录从O区中间开始，按Z-Y-A方向进行，每次 转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因。 v 转录的调控是在启动区和操纵区进行的。 v3个结构基因各决定一种酶： v Z 编码-半乳糖苷酶： v Y 编码-半乳糖苷透过酶： v A 编码-半乳糖苷乙酰基转移酶： v -半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷键的专一性酶，除 能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他-半乳 糖苷。 v -半乳糖苷透过酶的作用是使外界的-半乳糖苷(如 乳糖)透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内，所以， 如果用乳糖为大肠杆菌生长的惟一碳源和能源，这两种酶是 必需的。 v -半乳糖苷乙酰基转移酶的

21、作用是把乙酰辅酶A上的乙 酰基转移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖，它在乳糖的 利用中并非必需。 621 酶的诱导lac体系受调控的证据 v 在不含乳糖及-半乳糖苷的培养基中，lac+ 基因型大肠杆菌细胞内-半乳糖苷酶和透过酶的 浓度很低，每个细胞内大约只有1-2个酶分子。 v 但是，如果在培养基中加入乳糖，酶的浓度很 快达到细胞总蛋白量的6或7，每个细胞中可有 超过105个酶分子。 v 当有乳糖供应时，在无 葡萄糖培养基中生长的lac+ 细菌中将同时合成-半乳糖 苷酶和透过酶。 v 培养基中加入乳糖1- 2min后，编码-半乳糖苷酶 和透过酶的lac mRNA量就迅 速增加。 v 去掉乳糖后，

22、lac mRNA 量立即下降到几乎无法检测 到，表明乳糖确实能激发lac mRNA的合成。 v 研究诱导作用时很少使用乳糖，因为培养 基中的乳糖会被诱导合成的-半乳糖苷酶所 催化降解，从而使其浓度不断发生变化。 v v实验室里常常使用两种含硫的乳糖类似物: v 异丙基巯基半乳糖苷(IPTG) v 巯甲基半乳糖苷(TMG)。 v 另外，在酶活性分析中常用，发色底物O -硝基半乳糖苷(ONPG)，它们都是高效诱导物 。因为它们都不是半乳糖苷酶的底物，所以 又称为安慰性诱导物(gratuitous inducer)。 v 如果某种物质能够促使细菌产生酶而本 身又不被分解，这种物质被称为安慰诱导物.

23、v 同位素实验证明，酶的合成不是由前体 转化而来的，而是加入诱导物后新合成的。 v 已经分离在有诱导物或没有诱导物的情况下都能产生lac mRNA的突变体，这种失去调节能力的突变体称为永久型突变 体，为分两类：I型和O型。 v I型：野生型为I+，突变型为I- O型：野生型为O+，突变型为Oc。 v I+ I-或O+ Oc后，Z、Y、A结构基因均表现为永久表达 ，所以I基因被称为调节基因(regulatory gene)。 v I基因是一个产生阻遏物的调节基因，其产物使体系关 闭。 I-突变体由于不能产生阻遏物，使细胞成为lac永久表 达型。 I- / I+局部二倍体由于带有一个正常阻遏物，使

24、细 胞中的lac仍然被抑制。 v 遗传学图谱分析指出， Oc突变位于I与Z之间， 所以，lac体系的4个基因的序列为IOZY。 v 通过这些观察，Jacob和Monod推断Oc突变代表 DNA链上的一个位点或一个非编码区域，而不是一个 基因，因为可编码的基因具有互补性，而Oc没有这 一特性。 v O决定相邻Z基因的产物是诱导型合成还是永久 型合成，O区域称为操纵基因。 622 操纵子模型及其影响因子 v 1961年Jacob和Monod发表lac操纵子负控诱导模式，建 立了乳糖操纵子的控制模型，其主要内容如下： v (1) Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子 所编码； v (2

25、)该mRNA分子的启动区(P)位于阻遏基因(I)与操纵区 (O)之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效 表达； v (3)操纵区是DNA上的一小段序列（长26bp?,35bp)， 是阻遏物的结合位点； (4)当阻遏物与操 纵区相结合时，lac mRNA的转录起始受到 抑制； (5)诱导物通过与 阻遏物结合，改变它 的三维构象，使之不 能与操纵区相结合， 从而激发lac mRNA的 合成。 这就是说，有诱 导物存在时，操纵区 没有被阻遏物占据， 所以启动子能够顺利 起始mRNA的转录。 v 首先，诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合 v 而转运诱导物需要透过酶 v 透过酶的合成又需要诱导

26、。 v 第一个诱导物是如何达到细胞内的？ 1lac操纵子的本底水平表达 影响因子 v两种可能： v 一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞； v 一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成。 v v 研究表明，第二种解释是正确的。 v 其次，人们发现乳糖(葡萄糖-1，4-半乳糖) 并不与阻遏物相结合，真正的诱导物是乳糖的异 构体异构乳糖(葡萄糖-1，6-半乳糖). v 而异构乳糖是在-半乳糖苷酶的催化下由 乳糖形成的。 v 因此，乳糖诱导-半乳糖苷酶的合成需要 有-半乳糖苷酶的预先存在。 v解释： v 在非诱导状态下有少量的lac mRNA合成(大约每个 世代中有1-5个mRNA分子)，这种合成被

27、称之为本底水平 的组成型合成(background level constitutive synthesis)。 v v 由于阻遏物的结合并不是绝对紧密的，即使在它与 操纵基因紧密结合时，也会偶尔掉下来；这时启动子的 障碍被解除，RNA聚合酶开始转录。这种现象以每个细 胞周期1-2次的概率发生。 v 细菌生长在以甘油为碳源的培养基中，按照lac操纵子 本底水平的表达，每个细胞内可有几个分子的-半乳糖苷 酶和乳糖透过酶。 v 现在加入乳糖，在单个透过酶分子作用下，少量乳糖分 子进入细胞，又在单个-半乳糖苷酶分子的作用下转变成 异构乳糖。 v 某个异构乳糖与结合在操纵区上的阻遏物相结合并使后 者失

28、活而离开操纵区，开始lac mRNA的生物合成。 v 这些mRNA分子编码了大量的-半乳糖苷酶和乳糖透过 酶，其结果导致乳糖大量涌入细胞。 2大肠杆菌对乳糖的反应 v 多数乳糖被降解成为葡萄糖和半乳糖，但还有许 多乳糖被转变成异构乳糖，然后与细胞内的阻遏物结 合(虽然合成速度低，但是阻遏物仍继续合成，因此 必须有足够的异构乳糖才能使细胞维持去阻遏状态) ，阻遏物的失活促使mRNA高速合成，进一步提高了透 过酶和-半乳糖苷酶的浓度。 v 降解产生的葡萄糖被细胞用作碳源和能源，降解产 生的半乳糖则被另一套酶体系转变成葡萄糖，这些酶的 合成也是可诱导的。 v 一旦培养基和细胞中的所有乳糖都被消 耗完

29、毕，由于阻遏物仍在不断地被合成，有 活性的阻遏物浓度将超过异构乳糖的浓度， 使细胞重新建立起阻遏状态，导致lac mRNA 合成被抑制。 v 在细菌中，多数mRNA的半衰期只有几分钟，所 以在不到一个世代的生长期内，lac mRNA几乎从细 胞内消失。-半乳糖苷酶及透过酶的合成也趋向停 止，这些蛋白质虽然很稳定，但其浓度随着细胞的 分裂而不断被稀释。 v 如果在原有的乳糖被撤去之后的一个世代中再 加入乳糖，这时乳糖可以立即开始降解，因为此时 细胞内仍有一定浓度的透过酶和-半乳糖苷酶。 v lac操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下组成型合成的 ，该阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有34

30、7个氨基 酸残基，并能与1分子IPTG结合。 v 未经分级分离的细胞提取物的结合能力大约为每细胞结 合20-40个IPTG分子，因此推测每个细胞中有5-10个阻遏物 分子。观察发现在I-突变株细胞提取物中缺少阻遏物，从而 证明与IPTG结合的物质确实是蛋白质。 v 当I基因由弱启动子突变成强启动子，细胞内就不可能 产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个lac操纵子在这些 突变体中就不可诱导。 3阻遏物lac I基因产物及功能 v -半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是把乳糖分解成葡 萄糖及半乳糖(半乳糖在gal操纵子的作用下再转化成葡萄糖 )。如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌在耗 尽外源葡

31、萄糖之前不会诱发lac操纵子。 v 研究发现，葡萄糖对lac操纵子表达的抑制是间接的。 v 如在一个大肠杆菌突变体，它在糖酵解途径中不能将葡 萄糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，这些细菌的lac基因 能在葡萄糖存在时被诱导合成。所以，我们说不是葡萄糖而 是它的某些降解产物抑制lac mRNA的合成，科学上把葡萄糖 的这种效应称之为代谢物阻遏效应(catabolite repression)。 4葡萄糖对lac操纵子的影响 v 在大肠杆菌中，cAMP的浓度受到葡萄糖代谢的调节。 v 如果将细菌放在缺乏碳源的培养基中培养，细胞内cAMP 浓度就高； v 如果在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓

32、度就低； v 如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳 源，cAMP的浓度也会很高。 v 因此推测糖酵解途径中位于葡萄糖-6-磷酸与甘油之间 的某些代谢产物是腺苷酸环化酶活性的抑制剂。 5cAMP与代谢物激活蛋白 ZYAOP DNA 调控区 CAP结合位点 启动序列 操纵序列 结构基因 Z： -半乳糖苷酶 Y： 透酶 A：乙酰基转移酶 cAMPCAP复合物 v 大肠杆菌中的代谢物激活蛋白 v 由Crp基因编码，能与cAMP形成复合物。 v 凡Crp及腺苷酸环化酶基因突变的细菌都不能 合成lac mRNA，CRP和cAMP都是合成lac mRNA所必 需的。 v cAMP-CRP复合物是

33、激活lac的重要组成部分， 细菌对于此复合物的需要是独立的，与阻遏体系无 关，转录必须有cAMP-CRP复合物结合在DNA的启动子 区域上。 v Crp基因和环化酶基因的突变细菌即使同时也是 I-或Oc突变，都不能合成出lac mRNA。 v 所以，cAMP-CRP是一个不同于阻遏物的正调控 因子，而lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调 控体系作用下实现的。 v 半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等在降解过程中均 转化生成葡萄糖或糖酵解途径中的其他中间产物，所以，这 些糖代谢中有关的酶都是由可诱导的操纵子控制的。只要有 葡萄糖存在，这些操纵子就不表达，被称为降解物敏感型操 纵子(catabo

34、lite sensitive operon)。 v 实验证明这些操纵子都是由cAMP-CRP调节的。对大量操 纵子启动区的研究表明，CRP-cAMP结合位点存在序列特异性 。 v cAMP-CRP复合物与启动 子区的结合是lac mRNA合成 起始所必需的。 v 该复合物结合于启动子 上游，能使DNA双螺旋发生 弯曲，有利于形成稳定的开 放型启动子-RNA聚合酶结构 。 v 而阻遏物则是一个抗解 链蛋白(antimelting protein) ，阻止形成开放结构，从而 抑制RNA聚合酶的功能。 623 lac操纵子DNA的调控区P、O区 v 已经分离得到含有lac操纵子的DNA片段，发现P区

35、( 即启动子区)一般是从I基因结束到mRNA转录起始位点下游 5-10bp v 而O区(即阻遏物结合区)位于-7+28位，该区的碱基 序列有对称性，其对称轴在+11位碱基对。 v 实验表明，阻遏物与O区的结合影响了RNA聚合酶与 启动区结合形成转录起始复合物的效率。 624 lac操纵子中的其他问题 v1A基因及其生理功能 v A基因存在于lac操纵子中，编码了-半乳糖苷 乙酰基转移酶。 v 虽然乳糖本身不能被乙酰化，但这个酶能够把 乙酰基从供体上转移到半乳糖苷分子上。 v 自然界中存在着许多种能被-半乳糖苷酶降解的半乳 糖苷分子，它们的分解产物往往不能被进一步代谢，很容易 在体内积累。这是非

36、常有害的，因为不少半乳糖苷衍生物在 高浓度时是细胞正常生长的抑制物。 v 当有IPTG存在时,I-OcA-大肠杆菌的生长速度显著慢于相 应的A+株系，两组细胞的差异仅仅在于后者能将IPTG乙酰化 ，而乙酰化的IPTG不能被-半乳糖苷酶所分解。 v 所以，A基因虽然不在乳糖降解中起作用，但它抑制 了-半乳糖苷酶产物的有害性衍生物在细胞内积累，在生 物进化中是有意义的。 v 在一个完全被诱导的细胞中，-半乳糖苷酶、透过酶 及乙酰基转移酶的拷贝数比例为1:0.5:0.2。这个比例在一 定程度上反映了以-半乳糖苷作为惟一碳源时细胞的需要 。 v 不同的酶在数量上的差异是由于在翻译水平上受到调节 所致。

37、 v 这种调节有以下两种方式： 2lac基因产物数量上的比较 v(1)lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离， 从而终止蛋白质链的翻译。 v 这种现象发生的频率取决于每一个后续的AUG密码子 再度起始翻译的概率。因此，就存在着一个从mRNA的5 末端到3末端的蛋白质合成梯度。 v 对于大多数多顺反子mRNA分子来说，这种现象具有普 遍性。 v(2)在lac mRNA分子内部，A基因比Z基因更易受内切 酶作用发生降解，因此，在任何时候Z基因的完整拷 贝数要比A基因多。 v 事实上，对于某个活跃表达的多顺反子操纵子 ，该mRNA所编码的各种蛋白质的相对浓度都由每一 个顺反子的翻译频率所决定

38、。 C A B A: RNA polymerase B: lac repressor C: CRP-cAMP 63 色氨酸操纵子与负控阻遏系统 v 由于trp体系参与生物合成 不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控。 v 色氨酸的合成主要分5步完 成，每个环节需要一种酶，编码 这5种酶的基因紧密连锁在一起 ，被转录在一条多顺反子mRNA上 ，分别以trpE、trpD、trpC、 trpB、trpA代表，编码了邻氨基 苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦 磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构 酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3 -磷酶合成酶。 一、色氨酸操纵子的结构 调控基因 结构基因 催化分枝酸转变为色氨酸的酶 tr

39、pR trp v共有7个基因参与了色氨酸合成过程，编码了与 色氨酸合成有关的5个酶： v trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶 v trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶 v trpF编码异构酶 v trpC编码吲哚甘油磷酸合酶 v trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基。 v 在大肠杆菌等许多细菌中，trpE和trpG融合成一个 功能基因，trpC和trpB也融合成一个基因，产生具有双 重功能的蛋白质。 v 除上述7个基因之外，细菌中还有： v pabA，pabB基因分别编码ADC合酶的两个亚基 v pabC基因编码ADC裂解酶 v ubiC基因编码分枝酸裂解酶 v entC基因编

40、码异构分枝酸合酶 v 这些基因产物都在不同程度上参与了分 枝酸代谢，与色氨酸合成有一定关系。 v trpE基因是第一个被翻译的基因，和trpE紧邻的是启动子区和操纵区 。 v 另外，前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa(不是trpA)。 v trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远。 后者位于大肠杆菌染色体图上25 min处，而前者则位于90 min处。 v 在位于65 min处还有一个trpS(色氨酸tRNA合成酶)，它与携带有色 氨酸的tRNATrp共同参与trp操纵子的调控作用。trp操纵子的转录调控除 了阻遏系统以外，还有弱化系统。 L区编码了前导肽，

41、当有高浓度Trp存在时，由于弱化子a的作用，转 录迅速减弱停止，生成140核苷酸的前导RNA； 当Trp浓度较低时，弱化子不起作用，转录得以正常进行，生成长 约7kb的mRNA，操纵子中第一个结构基因的起始密码子AUG在+162处。 v特点: (1) trpR和trpABCDE不连锁； (2) 操纵基因在启动子内 (3) 有衰减子(attenuator)/弱化子 (4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被 前导序列(Leader)所隔开 631 trp操纵子的阻遏系统 v trpR基因突变常引起trp mRNA的组成型合成， 该基因产物因此被称为辅阻遏蛋白(aporepressor) 。除非培

42、养基中有色氨酸，否则这个辅阻遏蛋白不 会与操纵区结合。 v 辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏 物，与操纵区结合开关闭trp mRNA转录。 v 这个系统中的效应物分子是色氨酸，是由trp操 纵子所编码的生物合成途径的末端终产物。 v 当培养基中色氨酸含量较高时，它与游离的辅 阻遏蛋白相结合，并使之与操纵区DNA紧密结合； v 当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏物失去 色氨酸并从操纵区上解离，trp操纵子去阻遏。 色氨酸供应短缺时，基因活化 色氨酸过剩时，与阻遏因子结合，抑制基因转录 低低TrpTrp时：时： 阻遏物不结合阻遏物不结合 操纵基因操纵基因; ; 高高TrpTrp时：时： 阻

43、遏物阻遏物+ +TrpTrp 结合操纵基因结合操纵基因 632 弱化子与前导肽 v 6. 3. 2. 1 弱化子 v 阻遏不是惟一的调节机制。 v 在色氨酸高浓度和低浓度下观察到trp操纵子的表达水 平相差约600倍，然而阻遏作用仅使转录降低70倍。 v 此外，使阻遏物失活突变不能完全消除色氨酸对trp操 纵子表达的影响。 v 显然，trp操纵子的这种调控与阻遏物的控制无关，必 然还有其他调控机制。通过缺失突变株的研究发现，这种调 控机制就是弱化作用(attenuation)。 1、弱化子： DNA中可导致转录过早终止的一段核苷酸序列（123- 150区）。 123150 v 阻遏-操纵机制对

44、色氨酸来说只是一个一级开关，主 管转录是否启动，相当于trp操纵子的粗调开关。 v trp操纵子中对应于色氨酸生物合成的还有另一个 系统进行细调控并决定已经启动的转录是否继续下去。 在这个系统中，酶的浓度根据氨基酸浓度的变化而受到 调节。 v 这个细微调控是通过转录达到第一个结构基因之前 的过早终止来实现的，细胞中色氨酸的浓度是实现过早 终止的根本原因。 v 在trp mRNA 5端trpE基因的起始密码前有一个长162bp 的mRNA片段被称为前导区，其中123-150位碱基序列如果缺 失，trp基因表达可提高6-10倍。 v 当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸， 转录总是在

45、这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA 分子，终止trp基因转录，这就是123-150区序列缺失会提高 trp基因表达的原因。 v 因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节 的，这个区域就被称为弱化子。 v 研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我 配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。 6322 前导肽 v 实验表明衰减作用需要负载tRNATrp参与，这意味着前导 序列的某些部分被翻译了。 v 分析前导序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码 子UGA；如果翻译起始于AUG，应该产生一个含有14个氨基酸 的多肽。这个假设的多肽被称为前导肽。 v 有证

46、据表明事实上可能存在这个多肽，因为在该AUG位点 5上游端有一个核糖体结合位点，而前导肽编码区与trpE基 因5端融合可产生一种融合蛋白质，该蛋白质具有与前导肽 同样的N末端序列。 v前导序列具有一个非常有意义的特点: v在其第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。 在组氨酸操纵子中，也具有弱化子，也具有一个类似的 能编码前导肽的碱基序列，此序列中含有7个相邻的组氨酸密 码子。 苯丙氨酸操纵子中同样存在弱化子结构，其前导序列中也 有7个苯内氨酸密码子。 这些密码子参与了trp及其他操纵子中的转录弱化机制。 6323 mRNA前导区的序列分析 v trp前导区的碱基 序列的4个分别以1、2

47、、3和4表示的片段能以 两种不同的方式进行碱 基配对，有时以1-2和3 -4配对，有时只以2-3 方式互补配对。 v RNase T1降解实验 (此酶不能水解配对的 RNA)表明，纯化的trp前导序列中确有1-2和3-4 的配对方式; v 由此定位的3-4配对区正好位于终止密码子 的识别区，当这个区域发生破坏自我配对的碱基 突变时有利于转录的继续进行。 6324 转录弱化作用 v 转录的弱化理论认为:mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻 译来调节的。 v 因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以这个 前导肽的翻译必定对tRNATrp的浓度敏感。 v 当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载

48、有色氨酸的tRNAtrp也 就少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4 区被转录完成时，核糖体才进行到1区(或停留在两个相邻的Trp密 码子处)，这时的前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结 构，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转 录。 The trp Attenuator: 3、弱化机制 v 而当培养基中色氨酸浓度高时，核糖体可顺利 通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前， 核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以 自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止，trp 操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸。 v 所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依