分析化学李娜定分课件8-Basic (2).ppt

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1、第八章 吸 光 光 度 法 第八章 吸光光度法 8.1 吸光光度法的基本原理 8.2 光度分析的方法和仪器 8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度 8.4 显色反应与分析条件的选择 8.5 吸光光度法的应用 8.6 紫外可见分光光度法在有机 定性分析中的应用 获诺贝尔奖的仪器分析项目(1) W.H.Bragg & W.L.Bragg (英) 物理奖 1915 应用X射线研究晶体结构 F.W.Aston (英) 化学奖 1922 用质谱法发现同位素并应用于定量分析 F.Pregl (奥地利) 化学奖 1923 开创有机物质的微量分析法 F.Bloch & E.M.Purcell (美) 物理奖 19

2、52 发明核磁的测定方法 A.J.P.Martin & R.L.M.Syngc (英) 化学奖 1952 开创气相分配色谱分析法 武大仪分p3 获诺贝尔奖的仪器分析项目 (2) J.Hegrovsky (捷) 化学奖 1959 开创极谱分析法 R.Yalow (美) 生理医学奖 1977 开创放射免疫分析法 K.M.Siegbahn (瑞典) 物理奖 1981 发展高分辨率电子光谱学并应用于化学分析 R.R.Ernst (瑞士) 化学奖 1991 发展高分辨核磁共振波谱学方法 A.Zewail(美籍埃及人) 化学奖 1999 利用激光闪烁研究化学反应 化学分析： 利用化学反应及其计量关系来进行

3、分析 的方法。 仪器分析： 采用比较复杂或者特殊的仪器设备，通 过测量物质的某些物理或物理化学性质 的参数及其变化来确定物质的化学组成 、成分含量及化学结构的一类分析方法 。 化学分析与仪器分析的关系？ 1672, Isaac Newton 1802, Willian Hyde Wollaston Dark lines from the solar spectrum with a spectroscpoe Bunsen-Kirchhoff Spectroscope 1759-1860 光学分析法 光学分析法 光谱法 分子光谱法 UV/Vis,IR,MFS,MPS 非光谱法 （折射法，浊度法，旋

4、光法） 原子光谱法 AAS,AES, AFS （不以光的波长为特征讯号，通过测量电磁 辐射的某些基本性质的变化的分析方法。） （以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法 ，通过检测光谱的波长和强度来进行定性和定 量的方法。） 分子光谱学(1) *者为四大波谱 *紫外可见分光光度法(UV/Vis) Ultra Violet/Visible Spectrophotometry *红外吸收光谱法(IR) Infrared Spectroscopy 分子荧光光谱法(MFS) Molecular Fluorescence Spectroscopy 分子磷光光谱法(MPS) Molecular Phosph

5、orescence Spectroscopy 分子光谱学(2) 光声光谱法 (PAS) Photo Acoustic Spectroscopy 拉曼光谱法 (RS) Raman Spectroscopy *核磁共振波谱法(NMR) Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy *质谱法 (MS) Mass Spectroscopy 联用技术发展很快 物质的量与仪器的信号的联系 Sample Converter Reading 1.3 定量分析方法（2） 按试样量大小分： 方法 固体试样质量(mg) 液体试样体积(mL) 常量 100 10 半微量 10100

6、110 微量 1%) 微量组分 (0.01-1%) 痕量组分 (5105 高 物理意义： 最常用的形式： Abc A、T、b、k的名称 Akbc A 吸光度 Absorbance 光密度 Optical Density 用D或O.D表示 消光度 Extinction 用E表示 T 透射比 Transmission 透光度（率） Transmittance b 样品光程（Sample Path Length),单位为 cm。 一般为吸收池厚度。 K 吸光系数 Absorptivity 消光系数 Extinction Coefficient 吸收指数 Absorbancy Index 当c的单位用

7、gL-1表示时，用a表示，Aabc 当c的单位用molL-1表示时，用表示. A bc 摩尔吸光系数 Molar Absorptivity 或称摩尔吸光指数 Molar Absorbancy Index 当c的单位用g100mL-1表示时，用 表示 ， A bc， 叫做比消光系数 (Specific Extinction Coefficient). 吸光度与光程的关系 A = abc : 0.11 b 0.22 2b 0.33 3b 0.00 光源 检测器 显示器 吸光度与浓度的关系 A = abc 0.00 光源 检测器 显示器 0.22 b 0.44 b 吸光度与波长的关系A = abc

8、0.00 光源 检测器 显示器 0.00 b 0.22 b 朗伯-比尔定律的局限性 当溶质浓度很高（一般0.01mol/L)时， 分子之 间的距离与分子大小相比，静电作用影响摩尔吸 光系数的偏离 样品中粒子的散射 待测样品在测定波长下发荧光或磷光 在高浓度的电解质溶液中，折射指数发生变化 随着浓度的增加，化学平衡发生移动 非单色光发射，尽量选用max处测定 杂散光 吸光度的加和性 在含有多组分体系的吸光分析中， 往往各组分对同一波长的光有吸收。溶 液的吸光度等于各组分的吸光度之和： A = A1 + A2 + +An 8.2 光度分析的方法和仪器 8.2.1 光度分析的几种方法 目视比色法 光

9、电比色法 分光光度法 8.2.2 分光光度计的类型 目视比色法 通过眼睛观察比较溶液深浅来确定物 质含量的方法。 空 白 c1c2c3c4 浓浓度增大 观察方向 光电比色计结构示意图 722分光光度法 光电管 样品 聚光镜 出光狭缝 光栅 准直镜 聚光镜 进光狭缝 反射镜 滤光片 W灯 光 门 722型分光光度计光学系统 基础分析化学实验p92 722型分光光度计结构方框图 基础分析化学实验p93 分光光度法的基本部件 光源单色器吸收池检测系统 稳压电源 分光光度计的主要部件（1） 光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度且不随而改变。稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯 紫外区：氢灯，

10、氘灯 单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。 分光元件：滤光片，棱镜，光栅 吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。 可见光区：光学玻璃 紫外区：石英 分光光度计的主要部件（2） 检测器：利用光电效应，将光强度转换成 电流讯号。 光电池，光电管，光电倍增管 检流计（指示器）：将信号以适当方式显示 或记录。 低档仪器：刻度显示 中高档仪器：记录仪，数字显示 典型光源的发射光谱 钨灯：发射波长 3202500nm 可见光区光源 氢灯：发射波长180375nm 紫外光区光源 氙灯：紫外、可见光区均可用作光源 光源 /nm 钨灯（热辐射光源） 4006008001000 氙灯（气体放电光源

11、） 氢灯 强度 分光元件（1） 棱镜：依据不同波长光通过棱镜时有不同的 折射率而将不同波长的光分开。 玻璃：3503200nm 石英：1854000nm 单色器 入射狭缝 准直透镜 棱镜聚焦透镜出射狭缝 白光 红 紫 1 2 光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大 的等宽等间距条痕。 平面透射光栅 反射光栅（广泛使用） 原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光 。 分光元件（2） 反射光栅：紫外、可见： 600、1200、2400条/mm 红外 2030条/mm 滤光片（用在光电比色计上） 吸收滤光片：只允许指定的窄范围波长光通过， 其他波长的光均被吸收的滤光片(用于可见光区) 。 分光元件

12、（3 ） /nm T% 标称波长 带通半高宽 滤光片颜色max溶液颜色 红650 蓝绿 绿530 红紫 蓝440 黄 国产581型光电比色计 常用的几种滤光片 玻璃滤光片：由各种有色玻璃制成， 60nm 夹胶滤光片：用有机染料使塑料薄膜着色后夹在 光学玻璃中制成, 30nm40nm 干涉滤光片：根据光的干涉作用而设计的， 10nm。(用于紫外光区) 选择滤光片的原则： 滤光片透光率最大的光是有色溶液吸收 最大的光。即滤光片的颜色与有色溶液的颜 色互补。 吸收光谱法应用的检测器 TypeWL range, nmType of Spectroscopy Photon Detectors Photo

13、tubes Photomultiplier tubes Silicon photodiodes Photoconductive cells 150-1000 150-1000 350-1100 1000-50000 UV/Vis & Near IR UV/Vis & Near IR, Molecular Fluorescence Vis & Near IR IR Thermal Detectors Thermocouples Bolometers Pneumatic cells Pyroelectric cells 600-20000 600-20000 600-40000 1000-2000

14、0 IR IR IR IR 硒光电池（Barrier-layer photocell） 适用于300-800 nm, 在500-600 nm范围最灵敏 。 Se 阴极Au，Ag 半导体 h 阳极 硒光电池（Barrier-layer photocell） 待扫描 光电管(phototube) h （片 ） 光电管 红敏管 625-1000 nm 蓝敏管 200-625 nm Ni环（片 ） 碱金属 光敏阴极 h 光电倍增管 待扫描 160-700 nm 1个光子可产生106107个电子 722型分光光度计 光源：钨卤素灯12V、30W 波长范围：330800nm 分光元件：光栅，1200线/m

15、m 检测器：端窗式G1030光电管 多碱阴极真空管 300850nm 波长精度：2nm 光谱带宽：6nm 波长精度：仪器波长指示器所显示的波长 值与仪器对应输出的实际波长值之间的 符合程度。可用二者之差来衡量。 吸光光度法仪器主要差异比较 可见光 （380780nm ） 紫外 （200380nm) 中红外 （2.550 m ) 光源 钨灯 碘钨灯 3202500 氢灯 氘灯 180375 硅炭棒 （红外线） 棱镜材料 玻璃 （3503200） 石英 （1854000） NaCl晶体 液槽材料玻璃石英 NaCl晶体 单光束分光光度计 可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图 双光束分光光度计 (

16、Double-beam-in-space) 双光束分光光度计 (Double-beam-in-time) Varian Cary 1E 分光光度计光路图 3035mm 1200条/mm 30转/s Varian Cary 1E 紫外可见分光光度计 双光束型可以消除单光束仪器 受光源强度变化的影响 参比 样品 I0 I0 IR IS 光源 光电管 几种类型分光光度计的比较 多通道仪器（Multichannel Instruments ） 光电二极管阵列 photodiode arrays (PDAs) 纤维光度计 其他类型分光光度计 HP 8452A多通道二极管阵列分光光度计 镀铝反射镜 纤维光

17、度计示意图 纤维光度计 8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度 8.3.1 灵敏度的表示方法 摩尔吸光系数 桑德尔(Sandell)灵敏度 8.3.2 影响准确度的因素 对比尔定律的偏离 灵敏度，S Sandell灵敏度 定义：截面积为1cm2的液柱在一定波长或 波段处，测得吸光度为0.001时所含物质的 量。 用S表示，单位：gcm-2 由 A=bc A/bc(cmmol/1000cm3) 0.001/ L S越小，方法的灵敏度越高 S大多在0.010.001 gcm-2 例 已知用邻二氮菲光度法测定铁时， 5081.1104 Lmol-1cm-1 S = 55.85/(1.1104)0.005

18、1 gcm-2 用4,7-二苯基邻二氮菲光度法测定铁 5332.2104 Lmol-1cm-1 S = 55.85/(2.2104)0.0025 gcm-2 用双硫腙萃取光度法 测定铜时，4.5104 Lmol-1cm-1 ， 测定铅时，6.8104 Lmol-1cm-1 ， 计算S。 测Cu S = 63.55/(4.5104)0.0014 gcm-2 测Pb S = 207.2/(6.8104)0.0030 gcm-2 例 影响准确度的因素 对比尔定律的偏离 非单色光的影响 化学反应的影响 其他因素 光不纯引起的对Beer定律的偏离（1） 2 maxmax 2 max处，基本不变 2处，变

19、化较大 A A /nmc/mol/L 应尽量选择max作为测定波长（？） 光不纯引起的对Beer定律的偏离（2） 若1 2，则Abc 若1 2，则Abc 偏离朗伯比尔定律 两波长1,2的光经溶液被吸收 1处：A1lg(I0/It )=1bc ， 2处：A2lg(I0/It )=2bc ， I0=I0 +I0, It=It+It 其他因素对比尔定律的影响 被测溶液的浓度太大，使得吸光质点太接 近 摩尔吸光系数发生变化 溶液折光指数发生变化 化学因素引起对比尔定律的偏离 离解 络合 缔合 x104 (nm) 亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱 a. 6.3610-6 mol/L b. 1.2710-4

20、mol/L c. 5.9710-4 mol/L 亚甲蓝阳离子 单体 max= 660 nm 二聚体 max= 610 nm 8.4 显色反应与分析条件的选择 8.4.1 显色反应 8.4.2 反应条件的确定 8.4.3 测定中的干扰以及消除方法 显色剂 O 生色团：NN，NO， O C=S,N （共轭双键）e ： ： ： 助色团NH，OH，X （孤对电子）ne 有机显色剂 丁二酮肟 NN型：CH3CCCH3 HON NOH NN OH COOH SO3H OO型：磺基水杨酸 N NNOH OH ON型： （PAR） NH NH N S N S型： （双硫腙） 显色反应的选择 v灵敏度高，一般1

21、04 v选择性好 v显色剂在测定波长处无明显吸收。 对照性好, max60 nm . v反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。 v显色条件易于控制，重现性好。 1)确定测定波长 A (380nm) A(350nm) K2Cr2O7的工作曲线与吸收曲线 0.4 0.0 0.8 0.0 0.4 0.8 350 380 /nm cc 2)确定显色剂用量（c(M)、pH一定 ） c(R)c(R) c(R) 3)确定显色反应酸度（c(M)、 c(R)一定） pH1 Ay2 -Ay1时 A= Ax2 Ax1 与背景无关 nm I 散 射 光 导数分光光度法 A图 混合物导数光谱 0 1 2 3 4 紫外导数

22、光谱检测法 肝中茚满二酮类抗凝血杀鼠剂的固相萃取 谭家镒 中国刑警学院法化系，沈阳 分析化学97.10审稿 方法：肝匀浆用乙腈浸提，浸提液用6的 HClO4稀释，然后用GDX100大孔树脂萃 取，用二氯甲烷5mL洗脱杀鼠剂，40挥 干，剩余物用0.1molL-1NaOH4mL溶解后 ，紫外导数光谱测定。 紫外导数光谱检测法 a. 空白肝普通光谱 b. 2.5 mg/L敌鼠溶液的普通光谱 c. 空白肝二阶导数光谱 d. 2.5 mg/L敌鼠溶液的二阶导数光谱 A 0.0 c d a b D 260 340 /nm -0.2 络合物组成的测定摩尔比法 固定cM M + R MR 络合物组成的测定-

23、连续变化法 M:R=1:1 0.5 0.33 cR/cf cR/c f M:R=1:2 0.00.20.40.60.81.0 1.00.80.60.40.20.0 一元弱酸离解常数的测定 p330 HL HL （HL、L颜色不同） KaH+L/HL 高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得AHLHLc(HL)； 低酸度下，几乎全部以L存在，可测得AL Lc(HL). 代入整理： HL L 或 MO离解常数的测定 (1) Aa(HL) Ab 1 2 3 4 5 6 Ab 6 5 4 3 2 1 Aa Ab(L) 350400450500550600 /nm A 曲线pH 11.10, 1.38 22

24、.65 33.06 43.48 53.98 65.53,6.80 MO吸收曲线 基础分析化学实验 p322 MO离解常数的测定 (2) AHL 3.32(pKa) 123456 A pH=pKa pH 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 -0.4 -0.6 3.04.0 pH AL 3.32 请同学们下周一带书： 仪器分析教程 8.6 紫外可见分光光度法在有机 定性分析中的应用 8.6.1 有机化合物分子的电子跃迁和吸收带 8.6.2 有机分子中的生色团与助色团 8.6.3 有机化合物结构与吸收峰的关系 8.6.4 溶剂对吸收光谱的影响 8.6.5 计算不饱和有机化合物UV吸收波长的 经验规

25、则 8.6.6 应用 有机化合物分子的电子跃迁和吸收带 HCHO 跃迁 max(nm) *150( * *n * * n * * 跃迁（饱和烃类） 190CH2CH2 CH2 135 （CC）CH3CH2CH3 135 （CC）CH3CH3 125 （CH）CH4 max（nm） 饱和烃类 max nm max nm H2O1671480 CH3OCH31842520 CH3OH183150CH3NH2215600 CH3Cl173200(CH3)2NH220100 CH3Br204200(CH3)3N227900 CH3I258365 n* 跃迁（含杂原子） n* 跃迁（带孤对电子的杂原子与

26、其他键共轭 ） 280300饱和醛酮 1000( n*) 16( n*) 186 280 CH3COCH3 在异辛烷中22280CH3NO2 在EtOH中5339CH3NNCH3 在H2O中60214CH3CONH2 在EtOH中41204CH3COOH max(nm） * 跃迁（不饱和烃类) 6000173CH三CH 14000175CH2CH2 max(nm） 电荷迁移跃迁（荷移光谱） 特点：谱带宽,吸收强度大,max处的可大于104 。 Fe3SCN- Fe2SCN （分子内氧化还原） h R N 1 R2 R h DADA- e给予体 e接受体 e给予体e接受体 N 1 R2 - +

27、h C R O C R O-+ h 生色团类型 严格地说，只有含有不饱和基团或孤对电 子的基团，才是生色团（ * ， n*） CN，CCl： CO，CS n*， * n* ,* 200nm CC，CH ， * 150nm : : : CC ,C C * ,* 200nm （孤立双键 max 水 乙醇 己烷 A 溶剂极性对吸收光谱的影响 2 溶剂效应无溶剂效应 E1 E2 E2E1max 溶剂极性增大， * 吸收红移 CH3 305309315329 n * 243237238230 * 水甲醇氯仿正己烷溶剂 极性增大 例： 异亚丙 基丙酮 异亚丙基丙酮 max max 常用溶剂的光学透明区 C

28、HCl3245乙醚210苯280 环己烷210己烷210CCl4265 正丁醇210庚烷210DMF270 二氯甲烷235甲醇215丙酮330 二氧六环235异辛烷210吡啶303 乙醇210水210，250300硝基甲烷380 大于以上波长时使用 对溶剂的要求 1.低极性 2.易溶解被测物 3.稳定 4.在样品的吸收光谱区无明显吸收 定性分析 200800nm无吸收峰，可能是链状或环状的脂肪 族化合物，或其简单衍生物。(醇，胺 等) 210250nm有强吸收带(= 1 104 2 104),可能 有两个双键 210300nm强吸收带，可能有35个共轭双键 250300nm有吸收峰，表示有羰基

29、存在；有中强 吸收峰且有振动结构时，表示有苯环 。 常用工具书 Sadtler Standard Spectra Heyden,London,1978 46000种化合物的紫外光谱 Ultraviolet Spectra of Aromatic Compounds R.A.Friedel， Wiley,New York,1951 579种芳香族化合物 结合红外，核磁，质谱 定性 同分异构体的判断 max272，16，n * max =204， * max =300， n * max243，1.8104，* CH3C CH2 O C OC 2H5 O CH3C CH C OC 2H5 O OH

30、酮式 在极性溶剂中 烯醇式 在非极性溶剂中(正己烷 ) 乙酰乙酸乙酯 ? 243 己烷中* 204 * 272 n * 水中 (nm) 250300200 A 乙醇中 乙酰乙酸乙酯的紫外吸收光谱 顺反异构体的判断 反式1,2-二苯乙烯 max295 2.7104 顺式1,2-二苯乙烯 max280 1.1104 顺反异构体的判断 反式肉桂酸 max295 7000 顺式肉桂酸 max280 1.35104 250 300(nm) 5 10 x103I III-乙醚中 max300 * （分子内氢键） II-水中 max250 * 苯乙酰丙酮在乙醚(I),水中(II)的紫外光谱 CCH2CCH3

31、CCHCCH3 OOOOH 酮式 烯醇式 苯乙酰丙酮 （与水分子间的氢键 ） 分子荧光(Fluorescence) 分析 分子磷光(Phosphorescence)分析 8.7 分子荧光和分子磷光分析法 8.7.1 荧光激发(吸收)光谱，荧光(发射)光谱， 磷光光谱 8.7.2 荧光强度与物质浓度间的关系 8.7.3 荧光与分子结构的关系 8.7.4 影响荧光强度的主要因素 8.7.5 荧光光度计及荧光测定方法 8.7.6 荧光分析法的特点及应用 8.7.7 磷光分析法 1575年，西班牙医生N.Monardes发现。 1852年，Stokes对荧光产生的机理作了解释 ，并提出了“荧光”。 1

32、867年，首次用于分析测定。 1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计 。 1952年，商品荧光分光光度计出现。 含有n和电子的分子的几种能态 三重态单重态单重态基态 n * 发光机理（ Jablonski Diagram ） 荧光寿命 109107 s 磷光寿命 10410 s 吸收光谱 发射光谱 蒽的激发光谱（吸收光谱）和发射光谱（荧光光谱） 激发光谱 Excitation Spectrum 发射光谱 Emission Spectrum 色氨酸的激发光谱、荧光光谱和磷光光谱 南大p252 荧光分析法测定血清中的镁 镁-Oxine的激发光谱和发射光谱 / 基础分析化学实验 p33

33、1 定量分析的基础-荧光强度(F)与物质浓度(c)的关系 在稀溶液中： F2.3bcI02.3AI0 荧光物质的荧光效率(量子产率)： 荧光物质的吸光系数 b液层厚度 I0入射光强度 当b，I0一定时： FKc 高浓度时，荧光物质发生自熄灭和自吸收现象 使F与c不呈线性关系 F c 一般当bc0.05 时, F与c呈线性关系 80 40 00.060.12 0.18 c(mol/L) F 丁二酮/CCl4 ex= 422 nm em=464 nm 250350450 nm F 1 2 3 4 c(mol/L) 1. 0.015 2. 0.045 3. 0.150 4. 0.450 丁二酮的自吸

34、猝灭 荧光与分子结构的关系 （1） C O -O O COO- 荧光黄苯并芘 共轭双键体系越大,越易产生荧光 N O Mg N O C O COO - -O C O C O O - -O O N O - 荧光与分子结构的关系 （2） 酚酞（无荧光) 8羟基喹啉（弱荧光) 荧光黄 红色荧光 刚性平面结构分子有利于产生荧光 1 荧光与分子结构的关系 （3） C H 2 OH NN HO SO3Na 滂铬蓝黑R （无荧光)红色荧光 联二苯 0.2 芴 1.0 刚性平面结构分子有利于产生荧光 2 O N N OH SO 3 Na Al OH2 H2O 给电子基增强荧光： OH,OR,NH2,NHR,N

35、R2,CN等 吸电子基减弱荧光： COOH,C=O,NO2,NN,Cl,Br,I 等 与体系作用小的取代基影响不明显： SO3R,NH3,SH,F,R 芳香族化合物苯环上取代基的影响 （1） OH COOH OH COOH OH OH C O 水杨酸 取代基之间若生成氢键，增强分子平面性和 刚性会加强荧光。 芳香族化合物苯环上取代基的影响 （2） 浓度：稀溶液，Fc (bc0.05) 光源：应强度大，稳定。 酸度： 温度：t 低，增加。 影响荧光强度的主要因素 OH O - pH1,有荧光pH13,无荧光 有荧光无荧光 O H O- 荧光光度计示意图 F 透射光 吸收光谱 氙灯(或高压汞灯）

36、（200-800 nm) 光电倍增管 F 荧光分光光度计光路图 电源光度计记录仪 光电倍增管 试样液池 光源 光栅 光栅 反射镜 反射镜 激发单色器 发射单色器 荧光光度计光路图 可见紫外光度计光路图 Perkin-Elmer LS50 Fluorimeter. Perkin-Elmer LS50 样品腔 荧光光度法的应用 （1） N OH HO OH N=N HO SO3Na O OH O C C O OH H 8羟基喹啉(Al,Be等) 茜素紫酱R(Al,F-等) 黄酮醇(Zr,Sn等) 安息香(B,Zn,Ge,Si等) 用于测定无机离子的有机试剂 定量方法-标准工作曲线法 v确定测定波长

37、 ex，em； v用标样，在选定的ex，em下测F，做 工作曲线； v测未知样F，根据工作曲线计算浓度。 荧光分析法的特点 灵敏度高：测定下限0.10.001 g/mL, 比分光光度法高24个数量级。 相对灵敏度: 以喹啉硫酸氢盐的0.05mol/LH2SO4溶液(em 450nm）为标准，并定为1，然后与相同浓度荧光 物质的荧光强度进行比较。 选择性高。 荧光测定的选择性 蒽的激发和发射光谱 菲和蒽的荧光光谱 （激发波长 265 nm) 蒽 菲 菲在360 nm以上无吸收，用 365 nm激发光时，菲无荧光， 可以在400 nm测定蒽的荧光。 在265 nm, 蒽和菲均有吸收， 以此波长的光

38、激发，在350nm 只有菲有荧光，故可测定菲。 荧光光度法的应用（1） 生物化学分析，生理医学研究，临床检测 直接测定能产生荧光的物质。 如带苯环的氨基酸： 色氨酸，酪氨酸，苯基丙氨酸。 测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质 。 荧光熄灭法测定猝灭剂 Ni2+对AlPAN络合物有荧光猝灭作用， 可测Ni2+ 610-5 610-3 g/mL 测定举例: 以H2SO4为溶剂，吸收苯并芘。 萃取浓缩层析荧光分析 荧光测定： ex = 520 nm em= 545 nm 荧光光度法的应用 （2） 苯并芘 磷光分析法的应用 获得较强磷光应采取的措施： 低温，固体磷光，分子缔合物的形成 重原子效应(Ag+,Pb2+,Tl+盐类) 磷光分析仪器 液槽：低温时测磷光，石英液槽放入盛液氮 的石英杜瓦瓶中。 斩波片：在激发光单色器与液槽之间，以及在 发射光单色器与液槽之间各装一个斩波片。 应用：主要用于有机分析。