第04章核酸的结构与功能.ppt

《第04章核酸的结构与功能.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第04章核酸的结构与功能.ppt（108页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、第三章 核酸化学 Nucleic Acid Chemistry,李春梅 生物化学与分子生物学系,主要内容,一、核酸的分类、分布与功能 二、核酸的分子组成 三、核酸的分子结构 四、核酸的理化性质 五、核酸的提取与定量(自学),一、核酸的分类、分布与功能,（一）什么是核酸（ Nucleic Acid ）？ 核酸是以核苷酸为基本组成单位、通过3, 5-磷酸二酯键连接而成富含磷元素的酸性生物大分子，为生命的最基本物质之一，其主要功能是携带和传递遗传信息。,核酸结构示意图,3,5-磷酸二酯键,3,5-磷酸二酯键,一、核酸的分类、分布与功能,（二）核酸的分类与功能 核糖核酸（ribonucleic aci

2、d, RNA） 主要分布于细胞质，亦存在于细胞核、线粒体、叶绿体等。其主要功能是参与蛋白质的生物合成。 参与蛋白质合成的核糖核酸又分为三大类： 信使RNA（messenger RNA, mRNA） 转运RNA（transfer RNA，tRNA） 核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）,一、核酸的分类、分布与功能,（二）核酸的分类与功能 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA 主要存在于细胞核、线粒体和叶绿体。 DNA储存了生命活动的全部遗传信息，是物种保持世代繁衍和进化的物质基础。,主要内容,一、核酸的分类、分布与功能 二、核酸的分子组成 三、核酸的

3、分子结构 四、核酸的理化性质 五、核酸的提取与定量(自学),二、核酸的分子组成,核酸的元素组成 碳、氢、氧、氮、磷 核酸含磷量比较稳定，RNA含磷约9.0%，而DNA和核苷酸含磷约9.2%，故可以利用定磷来测定核酸含量。,二、核酸的分子组成,（一）核苷酸的组成,核酸(DNA和RNA),核苷酸,核苷或脱氧核苷,磷酸,戊糖,碱基,【核酸的基本单位】,核酸的水解,二、核酸的分子组成,（一）核苷酸的组成 1. 戊糖（pentose ）,1,2,3,4,5,二、核酸的分子组成,（一）核苷酸的组成 2. 碱基（base）,碱基,腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G）,嘌呤碱基（purine，Pu）,腺嘌呤(adeni

4、ne, A),鸟嘌呤(guanine, G),1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌呤碱基,嘧啶(pyrimidine，Py),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),1,3,2,4,5,6,嘧啶碱基,2019/6/20,广东药学院 李春梅,重要的碱基：如次黄嘌呤（Hypoxanthine，H)、黄嘌呤（Xanthine，X）。 稀有碱基：有些核酸中某些碱基的氢可被其他化学基团如甲基、羟甲基、-F、-S、乙酰基等取代，形成修饰碱基，通常含量很少，故称为。目前已发现几十种稀有碱基。 如7甲基鸟嘌呤（m7G)、 5甲基胞嘧啶（m5C)、 m

5、7A、F5U、 Nm6U等。,二、核酸的分子组成,（二）核苷酸的结构 1. 糖苷键与核苷 碱基与核糖或脱氧核糖通过糖苷键缩合形成核苷(nucleotide)、脱氧核苷(dioxynucleoside)。,核苷(nucleotide)或脱氧核苷(dioxynucleoside),腺嘌呤核苷 【腺苷, A】,1,9,1,9,【腺嘌呤】,【核糖】,核苷(nucleotide)或脱氧核苷(dioxynucleoside),【胞嘧啶】,【2-脱氧核糖】,胞嘧啶脱氧核糖 【脱氧胞苷, dC】,2019/6/20,广东药学院 李春梅,1,C5,假尿苷（） 1,C5-糖苷键,二、核酸的分子组成,（二）核苷酸的

6、结构 2. 磷酸酯键与核苷酸 核苷的戊糖与磷酸以磷酸酯键相连形成核苷酸。,核苷酸(ribonucleotide),腺苷酸 AMP,+,H2O,腺苷,核苷酸(ribonucleotide),核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯键结合构成核苷酸(ribonucleotide)或脱氧核苷酸(deoxyribonu-cleotide)。默认情况下核苷酸均为5-核苷酸。,腺苷酸(AMP),胞苷酸(CMP),核苷酸(ribonucleotide),核苷酸结构示意图：,磷酸,酯键,糖苷键,核苷,核苷酸,总结：DNA、RNA分子组成比较,DNA组成的基本单位：dAMP dGMP dCMP dTMP RNA组成的基本单位

7、： AMP GMP CMP UMP,二、核酸的分子组成,（二）核苷酸的结构 3. 酸酐键与高能化合物 一磷酸（脱氧）核苷可以通过酸酐键结合第二个、第三个磷酸基，形成二磷酸（脱氧）核苷（NDP/dNDP）和三磷酸（脱氧）核苷（NTP/dNTP）。,AMP,ADP,ATP,二、核酸的分子组成,（二）核苷酸的结构 3. 酸酐键与高能化合物 一磷酸（脱氧）核苷可以通过酸酐键结合第二个、第三个磷酸基，形成二磷酸（脱氧）核苷（NDP/dNDP）和三磷酸（脱氧）核苷（NTP/dNTP）。,ATP,、-磷酸基是高能基团,核苷酸的命名,AMP adenosine monophosphate 一磷酸腺苷 或 腺苷

8、一磷酸 简称：腺苷酸 ADP adenosine diphosphate 二磷酸腺苷 或 腺苷二磷酸 ATP adenosine triphosphate 三磷酸腺苷 或 腺苷三磷酸,核苷酸的命名,dAMP deoxyadenosine monophosphate 脱氧一磷酸腺苷 或 脱氧腺苷一磷酸 简称：脱氧腺苷酸 dADP deoxyadenosine diphosphate 脱氧二磷酸腺苷 或 脱氧腺苷二磷酸 dATP deoxyadenosine triphosphate 脱氧三磷酸腺苷 或 脱氧腺苷三磷酸 习惯上把核苷酸的通式书写为： NMP、NDP、NTP或者dNMP、dNDP、d

9、NTP （N代表任意一个碱基的符号）,二、核酸的分子组成,（二）核苷酸的结构 4. 磷酸二酯键与环核苷酸 环腺苷酸（cAMP）和环鸟苷酸（cGMP）,cAMP,5,3,细胞间信号传导示意图,细胞膜外的激素信号为第一信使，通过跨膜蛋白的连锁反应，生成第二信使cAMP。 生成的cAMP最终引发激素（第一信使）的生物学作用。,含核苷酸的生物活性物质： NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP,主要内容,一、核酸的分类、分布与功能 二、核酸的分子组成 三、核酸的分子结构 四、核酸的理化性质 五、核酸的提取与定量(自学),三、核酸的分子结构,一级结构（primary structur

10、e）,二级结构(secondary structure),三级结构(tertiary structure)：超螺旋结构、染色体结构,空间构象,三、核酸的分子结构 （一）核酸的一级结构,核苷酸的连接方式,5-末端,3,5-磷酸 二酯键,3-末端,3,5-磷酸 二酯键,核苷酸的链接方式为：3,5-磷酸二酯键 核酸链的方向是53 交替的磷酸基团和戊糖构成核酸链的骨架 (backbone),（一）核酸分子的一级结构,核酸的一级结构是核酸分子的核苷酸序列，由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。 核酸分子的大小常用碱基（base）数目或碱基对（base pair，bp）来表示。小的核酸片段

11、（50bp）则被称为多核苷酸。,P,R,N,P,OH,5,3,5 pApTpCpGpApTpCpG-OH 3,5 pATCGATCG-OH 3,ATCGATCG,核苷酸简式,核酸的书写方法,生物化学,护理学专业本科教材,（二）DNA的二级结构 1. DNA双螺旋结构的研究背景,20世纪20年代，大多数科学家认为蛋白质是遗传物质，而不是DNA,1944年Avery等利用从致病肺炎球菌中提取的DNA使另一种非致病性肺炎球菌的遗传性状改变而成为致病菌，证实了遗传物质是DNA而不是蛋白质,Avery,生物化学,护理学专业本科教材,生物化学,护理学专业本科教材,DNA双螺旋结构的研究背景,1951年，

12、Pauling利用X线晶体衍射技术研究角蛋白的空间结构，发现了蛋白质的螺旋结构,螺旋结构理论首次用分子形成螺旋这种方式解释生物大分子的空间结构,Linus Pauling,生物化学,护理学专业本科教材,DNA双螺旋结构的研究背景,Franklin获得高质量的DNA X射线衍射图谱,生物化学,护理学专业本科教材,DNA双螺旋结构的研究背景,Wilkins通过 X射线衍射获得了精确的DNA分析数据,生物化学,护理学专业本科教材,DNA双螺旋结构的研究背景,1952年， Chargaff等科学家采用层析和紫外吸收光谱分析等技术发现了DNA碱基的组成规律（Chargaff定律）,Chargaff,生物

13、化学,护理学专业本科教材,DNA双螺旋结构的研究背景,综合了前人的研究成果，Watson和 Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型 ，并于1953年4月在英国Nature杂志上发表,生物化学,护理学专业本科教材,DNA双螺旋结构示意图,A T,G C,DNA 俯视图,（二）DNA二级结构双螺旋结构 2. 结构要点： （1）DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链围绕同一中心轴构成的双螺旋结构，一条链的走向是53，另一条链是35。两条多核苷酸链都是右手螺旋。,2019/6/20,广东药学院 李春梅, 两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条53，另一条35,

14、（2）两条链中，磷酸与脱氧核糖链位于螺旋外侧，碱基位于内侧。碱基平面与脱氧核糖平面垂直。螺旋表面形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)。这些沟状结构与DNA、Pr之间识别有关。,2019/6/20,广东药学院 李春梅, 磷酸与脱氧核糖彼此通过3、5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。,磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。,2019/6/20,广东药学院 李春梅,（3）双螺旋的直径为2 nm，碱基平面与螺旋纵轴垂直。相邻碱基平面距离0.34 nm，螺旋一圈螺距3. 4 nm，一圈10对碱基。,2019/6/20,广东药学院 李春梅, 每

15、圈螺旋10.4nt ，碱基堆积距0.34nm，双螺旋平均直径2.37nm， 大沟：宽1.2nm ，深0.85nm， 小沟 ：宽0.6nm，深0.75nm,（4）两条链之间通过碱基之间形成的氢键配对联系。（互补配对形式：A=T; GC）。氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。,2019/6/20,广东药学院 李春梅,3. 其他二级结构,三、核酸的分子结构,（三）DNA的三级结构 1. 超螺旋（supercoil）结构 DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。 超螺旋结构依据螺旋的方向又分为： 正超螺旋：盘绕方向与DNA双螺旋方同相同。 负超螺旋：盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。,原

16、核生物DNA的超螺旋结构,2019/6/20,广东药学院 李春梅,2. 染色体结构,(1) 染色体的组成,DNA RNA：含量最少，变化最大。 组蛋白：H1、H2A、H2B、H3和H4共5种。 非组蛋白：含量不稳定，种类繁多，具有种属和组织特异性，在真个细胞周期均可合成。,2019/6/20,广东药学院 李春梅,2. 染色体结构,(2) 染色体的结构,核小体：真核细胞染色体的基本单位，由200 bp DNA和组蛋白构成的念珠状结构。,2019/6/20,广东药学院 李春梅,2019/6/20,广东药学院 李春梅,2019/6/20,广东药学院 李春梅,2. 染色体结构,(2) 染色体的结构,核

17、小体：真核细胞染色体的基本单位，由200 bp DNA和组蛋白构成的念珠状结构。 螺线管（30nm纤维） 超螺线管（300nm纤维） 染色单体：700nm,2. 染色体结构,DNA双螺旋,核小体,超螺线管,染色体,螺线管,3. DNA三级结构的生理意义,DNA分子在长度上高度压缩，有利于装配 超螺旋结构影响DNA复制和转录,4. DNA的功能,DNA是遗传信息的载体，主要以基因的形式携带遗传信息，是生物遗传的物质基础，。 基因（gene）是DNA分子中的功能性片段，是能编码有功能蛋白质或合成RNA所必需的完整序列。 生物体的全部基因序列称为基因组(genome)，包含了所有编码RNA和蛋白质的

18、序列及所有的非编码序列，也就是DNA分子的全序列。,（四）RNA的种类和分子结构,RNA的一般特点 RNA比DNA小很多； RNA的种类、大小和结构表现出多样性；RNA通常以单链的形式存在，但有复杂的局部二级结构或三级结构（右手螺旋结构、茎环结构）。,RNA结构示意图,发夹结构（Hairpin）/茎-环结构（stem-loop）,（四）RNA的种类和分子结构,RNA的种类及功能,1. 信使RNA（mRNA） 特点：（1）含量少：占总RNA的2% 5%； （2）种类多：可达105种； （3）寿命短：细菌半衰期约为1.5 min， 脊椎动物半衰期为3 h。,（四）RNA的种类和分子结构,内含子 (

19、intron),1. 信使RNA（mRNA） * mRNA成熟过程,外显子 (exon),（四）RNA的种类和分子结构,2019/6/20,广东药学院 李春梅,* mRNA结构特点,（1）大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,（2）大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,2019/6/20,广东药学院 李春梅,帽子结构,2019/6/20,广东药学院 李春梅,mRNA核内向胞质的转位 mRNA的稳定性维系 翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,2019/6/20,

20、广东药学院 李春梅,（3）mRNA依据自身的碱基序列指导蛋白质氨基酸序列的合成，也就是为蛋白质的生物合成提供模板 mRNA分子上从5至3方向，由AUG开始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸或蛋白质合成的起始、终止信号，称为密码子，或三联体密码(triplet coden)。 （4）mRNA的成熟过程是hnRNA的剪接过程,* mRNA结构特点,2019/6/20,广东药学院 李春梅,* mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,（四）RNA的种类和分子结构,2. 转运RNA（tRNA） （1） tRNA一

21、级结构特点 单链小RNA，长73 nt93 nt个，在三种RNA中质量最小 含 10 % 20% 稀有碱基，如 DHU,稀有碱基,由四种基本碱基衍生出的其他各种碱基称为稀有碱基。如：,（四）RNA的种类和分子结构,2. 转运RNA（tRNA） （1） tRNA一级结构特点 单链小RNA，长73 nt93 nt个，在三种RNA中质量最小 含 10 % 20% 稀有碱基，如 DHU 5端核苷酸往往是鸟苷酸 3-末端最后的三个核苷酸总是CCA（“氨基酸臂”）。,（四）RNA的种类和分子结构,2. 转运RNA（tRNA） （2） tRNA二级结构特点“三叶草形”,三叶草,tRNA,（四）RNA的种类和

22、分子结构,2.转运RNA（tRNA） （2） tRNA二级结构特点“三叶草形” 二氢尿嘧啶环（DHU） 反密码环,反密码环与反密码子,tRNA的反密码子环上有一个由三个核苷酸构成的反密码子(anticodon)。 tRNA上的反密码子依照碱基互补的原则识别mRNA上的密码子。,（四）RNA的种类和分子结构,2. 转运RNA（tRNA） （2） tRNA二级结构特点“三叶草形” 二氢尿嘧啶环（DHU） 反密码环 胸苷假尿苷环（T） 氨基酸臂（CCA）,（四）RNA的种类和分子结构,2. 转运RNA（tRNA） （3） tRNA三级结构特点“倒L形”,倒L形,tRNA的功能 活化、搬运氨基酸到核糖

23、体，参与蛋白质的翻译,（四）RNA的种类和分子结构,3. 核糖体RNA（rRNA）,大肠杆菌16S rRNA,rRNA的功能 参与组成核糖体，作为蛋白质生物合成的场所。,* rRNA的结构,（四）RNA的种类和分子结构,3. 核糖体RNA（rRNA） 含量最多：占RNA总量的80%85%； 寿命长：半衰期长，更新慢； 种类少：原核生物有5S、16S和23S三种， 真核生物有5S、5.8S、18S和28S四种。 rRNA与数十中蛋白质形成了一个小的复合物（小亚基）及形成了一个大的复合物（大亚基），大小复合物聚合形成有活性的核蛋白体,核蛋白体的组成,（四）RNA的种类和分子结构,4. 核酶（rib

24、ozyme） 由活细胞合成，起催化作用的RNA,（四）RNA的种类和分子结构,5. 其他RNA: 大小为20 nt 300 nt 核内小RNA（snRNA） 核仁小RNA（snoRNA） 胞质小RNA（scRNA） 小片段干扰RNA（siRNA） 研究细胞内全部RNA基因和RNA的分子结构和功能的一门学科，称为RNA组学。,主要内容,一、核酸的分类、分布与功能 二、核酸的分子组成 三、核酸的分子结构 四、核酸的理化性质 五、核酸的提取与定量(自学),四、核酸的理化性质,（一）紫外吸收特征,对酸碱的稳定性：DNA对碱稳定，易被酸破坏；RNA对酸稳定，易被碱破坏。 粘度：DNA粘度极大（线性高分子

25、），RNA小（RNA分子远小于DNA） 紫外吸收：DNA、RNA有260nm紫外吸收（嘌呤、嘧啶碱基有共轭双键）。,2019/6/20,广东药学院 李春梅,1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,OD260的应用,四、核酸的理化性质,（二）核酸的变性、复性与杂交 1. 变性（denaturation） 在一定条件下（例如加热）对开双链核酸碱基对氢键，可以使其局部解离，甚至完全解

26、离成单链，形成无规则线团，也称为溶解（melting）。,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,四、核酸的理化性质,（二）核酸的变性、复性与杂交 1. 变性（denaturation） 在一定条件下（例如加热）对开双链核酸碱基对氢键，可以使其局部解离，甚至完全解离成单链，形成无规则线团，也称为溶解（melting）。 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等,变性后其它理化性质变化：,OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应（hyperchromic eff

27、ect） ：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的温度，成为解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)、变性温度、熔点。其大小与G+C含量成正比。,六、核酸的理化性质,（二）核酸的变性、复性 2. 复性（renaturation） 两股单链核酸的序列部分互补或完全互补，则在一定条件下可以自发结合

28、，形成双链结构，称为“退火（annealing）”。 复性：同一来源的变性核酸单链部分互补或完全互补，则在一定条件下可以形成双链结构的过程。 核酸复性时260nm的紫外吸收将下降，称为减色效应（hypochromic effect）。,变性与复性示意图,六、核酸的理化性质,（二）核酸的变性、复性 3. 杂交 不同一来源的变性核酸单链部分互补或完全互补，则在一定条件下可以形成双链的过程，称为杂交(heteroduplex)。,核酸分子杂交示意图,2019/6/20,广东药学院 李春梅,2019/6/20,广东药学院 李春梅,DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,2019/6/20,

29、广东药学院 李春梅,2019/6/20,广东药学院 李春梅,核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础,主要内容,一、核酸的分类、分布与功能 二、核酸的分子组成 三、核酸的分子结构 四、核酸的理化性质 五、核酸的提取与定量(自学),五、核酸的提取与定量,（一）核酸的提取 主要步骤： 破碎细胞 出去多余的蛋白质、多糖等生物大分子 分离核酸（DNA或RNA） 出去杂质,（二）核酸定量 定磷法 定糖法（二苯胺法、地衣酚法） 紫外吸收法,本章的主要内容,一、核酸的分类、分布与功能 二、核酸的分子组成 三、核苷酸的代谢 四、DNA的结构与功能 五、RNA的结构与功能 六、核酸的理化性质,