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1、第十二章 基因功能分析的基本策略,基因功能是在细胞组成的多层次的复杂生命体中实现的，因此对基因功能的研究将极大程度上依赖于对模式生物的研究。 基因敲除技术、转基因动物模型、基因转染细胞模型、RNA干涉技术的发展，成为基因功能分析的有力工具。,第一节 利用转基因模型研究基因的功能,利用动物模型研究未知基因的功能，就是将某一基因从动物基因组中剔除或将外源基因引入动物基因组，产生在遗传上经过基因工程修饰（改造）的动物，实现在整体动物、细胞或分子水平上认识基因的功能或人类疾病发生的分子机制。,转基因技术概念,转基因技术是指将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中，通过外源基因与细胞染色体DNA之间随机重
2、组的发生而将外源基因插入到受体细胞染色体DNA上的过程。 利用转基因技术可以制备转基因生物或稳定转染细胞。通常所指的转基因生物是指将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中，使外源基因通过随机重组插入到受体细胞的染色体上，并随细胞的分裂而将外源基因遗传给后代。,一、转基因动物,转基因动物是指应用转基因技术培育出的携带外源基因的动物。 转基因过程： 1、转基因载体的构建； 2、将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞； 3、将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内； 4、对转基因动物进行鉴定。,转基因动物应用,1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达的时相； 2、在活体内研究或发现基
3、因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；,1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特定部位； 2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基因组功能； 3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同，可能出现不同表现型； 4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传。,转基因技术存在的问题,二、稳定转染细胞,稳定转染细胞是一种最常用的细胞水平的转基因模型，外源基因通过转基因过程插
4、入到细胞染色体中，使外源基因可以作为细胞染色体的一部分得以在细胞中稳定表达。 稳定转染细胞基本过程：1、真核重组表达质粒的构建：将外源基因和真核表达质粒连接构建成重组质粒；2、在原核细胞中复制扩增和克隆化真核重组表达质粒；3、将重组表达质粒转染哺乳动物细胞；4、重组质粒转染细胞的克隆化筛选、保存；5、转染细胞表达目的蛋白、提取、鉴定。,第二节 基因敲除技术,基因敲除技术是指通过DNA同源重组定向将外源基因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生物体内失活的过程。 如果通过同源重组定向地在活体内剔除特定基因的动物称为基因敲除动物。目前基因敲除小鼠是应用最广泛的动物模型之一。,基因敲除
5、技术的基本过程：,1、打靶载体的构建：一般包括三次DNA体外重组 、将待剔除基因作为目的基因克隆到特定克隆载体上； 、将带有目的基因的重组载体作为克隆载体，利用合适的内切酶将目的基因片段的大部分切除，使目的基因活性足以丧失，然后以此线性载体作为克隆载体，将一个阳性筛选标志基因插入连接到目的基因的中段；例如；Neor基因：使细胞具有抵抗新霉素（G418）能力。,、在目的基因外侧线性化重组载体，并将一个阴性筛选标志基因克隆到此。例如：单纯庖疹病毒（HSV）的胸苷激酶的编码基因为HSV-tk。当它在细胞内合成出胸苷激酶时，可以分解细胞培养液中加入的单核苷酸类似物而产生有毒的分解物使细胞死亡。 这样打
6、靶载体包含了部分待剔除的基因片段、阳性筛选标志基因、阴性筛选标志基因。,在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时，打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进行鉴定。,2、将打靶载体导入小鼠胚胎干细胞中；胚胎干细胞通常取自小鼠胚胎早期的内细胞团，该细胞能在体外培养，并保留发育的全能性。 3、用阳性筛选标志和阴性筛选标志对转染的胚胎干细胞进行筛选。 4、将发生同源重组的胚胎干细胞导入小鼠胚泡中，然后将胚泡植入假孕小鼠子宫中； 5、筛选嵌合体小鼠。通常同源重组
7、一般只发在一条染色体上，可以用Neor基因作探针，通过Southern blot鉴定。 6、杂交育种，获得基因剔除的纯合体小鼠,打靶载体,内切酶消化,线性化打靶载体,转染,基因组,同源重组,同源重组的胚胎干细胞,胚泡,植入,假孕小鼠,杂合子小鼠,正常小鼠,杂合子小鼠,交配,杂合子小鼠,兄妹交配,纯合子小鼠（基因剔除）,条件性基因敲除、条件性组织特异性基因敲除：,条件性基因敲除主要是通过CreLoxP或者FtpFRT 重组系统来实现的。这两个系统都是位点特异性重组酶 系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。 这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特
8、定的组织器官。 此外，若与控制Cre或Ftp表达的其他诱导系统相结合， 还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。,CreloxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。 该系统含有两种成分：一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of Xover in P1)。 Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶
9、的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。,CreloxP系统的原理,第三节 利用基因沉默技术对基因功能进行分析,结构基因功能最终是通过其表达的蛋白质来体现，因此结构基因功能的研究可以在RNA水平上进行，通过干预蛋白质的翻译过程或减少蛋白质的产量来分析基因的功能。目前在RNA水平上分析基因功能的方法主要有两类：一类是反义RNA技术封闭mRNA的功能；另一类是RNA干涉技术使基因处于沉默状态。,一、反义RNA技术,反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补RNA。根据反义RNA的作用机制可将其分为三类： 1、反义RNA是直接作用于
10、靶mRNA的核蛋白体结合位点或与靶mRNA直接结合形成双链RNA，从而直接抑制mRNA的翻译或被RNA酶识别降解。 2、反义RNA是与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象的变化，从而抑制其翻译。 3、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶mRNA的转录。,二、RNA干涉技术,最早是由Andrew Fire 和Craig Mellocai 两人在1998年2月一次实验中，将双链RNA注射给线虫，发现其可以引起一种高效、特异的基因抑制效应，他们将这种由双链RNA引起的特异性基因抑制现象称为RNA干涉。 RNA干涉技术是指由短的双链RNA诱导的同源RNA降解的过程，可使基因的表达受到抑制。它
11、是在基因的转录后水平抑制基因表达的一种研究基因功能的方法。,RNA干涉的机制：,Dicer是由核酸内切酶和解旋酶等组成的酶复合体。 当细胞内出现异常双链RNA时，如病毒RNA，可以激活Dicer，被激活的Dicer识别并将其切割成短的双链RNA，同时生成的短的双链RNA又可以进一步激活Dicer，并与之结合，形成的复合物称为RNA诱导的沉默复合物。 该复合物通过Dicer中的解旋酶将短的双链RNA变成互补单链RNA，此单链RNA即可识别并结合到细胞内与其互补的靶RNA分子上，并通过Dicer中的核酸内切酶将靶RNA切割，使其失去功能。RNA干涉可以被认为是机体的一种防御机制。,RNAi整个过程
12、一般分为3个阶段： 1.长dsRNA分子跨过细胞膜进入细胞内。 2.长dsRNA分子在Dicer酶作用下，被降解成长度为20- 25nt的siRNA分子。 3.siRNA与RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complexes，RISCs）结合并引导RNA诱导沉默复合物 与互补的mRNA分子结合，在RISCs中某些内切核酸酶 的作用下降解mRNA靶分子。,dsRNA,Dicer,形成复合物,靶RNA,干扰RNA,RNAi研究的一般技术路线,RNA干涉技术的基本过程,1、确定干涉靶点 选择目标基因是进行RNA干涉的第一步，根据靶基因序列，确定干涉的具体靶点。 一般作为干涉的靶点序列应具备：、目标RNA上被干涉的靶点应尽量避开蛋白结合位点、被干涉的靶序列一般应具有AA（N19）TT或AA（N21）序列特征，同时G：C比为50%左右被干涉的靶序列应该是特异性的，和其它RNA没有同源性。,2、双链干涉RNA的合成； 化学合成法；体外转录法; 3、双链干涉RNA对目标RNA的干涉： 首先，将干涉RNA转染到靶细胞； 其次，是对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-PCR在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平上进行监测,