第1章核酸化学.ppt

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1、第一章 核酸的结构与功能,Nucleic Acids,本章内容,第一节 核酸概述 第二节 核苷酸 第三节 核酸的分子结构 第四节 核酸的性质及分离提取 第五节 核酸与蛋白质的复合体,第一节 核酸概述,一、核酸是大分子 二、核酸的基本元素组成 三、核酸的种类 四、分布,核 酸(nucleic acid),是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。,一、核酸是大分子,分子量： RNA 几万几百万 DNA 1.61062.2109 功能：核酸是活细胞中最关键组分；它携带着遗传信息，是遗传的物质基础；它决定蛋白质和酶的结构。因此，它决定每一种生物体的代谢类型及形态。,DNA双螺旋图,D

2、NA俯视图,二、核酸的基本元素组成,C、H、O、N、P（9%10%） 可以测定磷含量推算核酸含量,三、核酸的种类,核酸,脱氧核糖核酸,核糖核酸,转运核糖核酸 tRNA,信使核糖核酸 mRNA,核糖体核糖核酸 rRNA,遗传信息的载体,(DNA ),(RNA ),遗传信息传递或遗传信息的载体,mRNA 半寿期最短，占总RNA5%-10% 功能：是蛋白质合成的模板。 tRNA 分子量最小，占总RNA10%-15% 功能：翻译中携带活化的氨基酸。 rRNA 含量最多，占总RNA75%-80% 功能：是蛋白质合成的场所。,特 点,四、分布,真核生物 原核生物,细胞质（90%） 核仁（少量）,DNA,细

3、胞核（98%） 细胞质（少量） 线粒体（少量） 叶绿体（少量）等,细胞质（类核部分） 质粒DNA 病毒DNA,RNA,细胞质 病毒RNA,第二节 核酸的化学组成,一、核酸的化学组成 二、核苷、核苷酸的形成 三、核苷酸的种类 四、核苷酸的功能,一、核酸的化学组成,核酸可在核酸酶（或酸、碱）作用下降解为核苷酸。,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,戊糖,碱基,戊糖,-D-核糖 -D-脱氧核糖 -D-2-O-甲基核糖,稀 有 碱 基,m5C,DHU,m62A,I,碱基和核糖（或脱氧核糖）通过糖苷键连接形成核苷(nucleoside) （或脱氧核苷）。,二、核苷、核苷酸的形成,（一）核苷的形成,二、核苷、核苷酸

4、的形成,（一）核苷的形成,+戊糖上半缩醛-OH,嘌呤N9-H,嘧啶N1-H,核苷,脱水,（二）稀有核苷的形成,（1）碱基稀有 （2）核糖稀有 （3）连接方式稀有,（三）核苷酸的形成,核苷（脱氧核苷）和磷酸以酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。自然界中存在的5-核苷酸。,三、核苷酸的种类,核苷一磷酸 核糖核苷一磷酸 AMP、GMP、CMP、UMP 脱氧核苷一磷酸 dAMP、dGMP、dCMP、dTMP,核苷二磷酸 核糖核苷二磷酸 ADP、GDP、CDP、UDP 脱氧核苷二磷酸 dADP、dGDP、dCDP、dTDP,核苷三磷酸 核糖核苷三磷酸 ATP、GTP、CTP、UTP 脱氧核苷三磷酸 dAT

5、P、dGTP、dCTP、dTTP,核苷酸 NMP，NDP，NTP,环式核苷酸 cAMP cGMP AP,四、核苷酸的功能,作为核酸的单体 细胞中的携能物质（如ATP、GTP） 酶的辅助因子的结构成分（如NAD、FMN、FAD） 细胞通讯的媒介（如cAMP、cGMP）,第三节 核酸的分子结构,一、核酸的一级结构 二、DNA 的空间结构和功能 三、RNA 的结构和功能,一、核酸的一级结构,定义 核酸中核苷酸的排列顺序。 由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。,核苷酸之间以3 , 5 -磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。,C,G,A,一个核苷酸3OH 与另一个核苷酸5H3PO4

6、脱水形成3，5 磷酸二酯键。 核苷酸通过3，5 磷酸二酯键相连形成的大分子称为核苷酸链。,书写方法,DNA 与RNA的区别,二、DNA 的空间结构与功能,（一）DNA的二级结构 （二）DNA 的三级结构,一、 DNA的二级结构 双螺旋结构,它必须能够携带遗传信息 能够自我复制传递遗传信息 能够让遗传信息得到表达以控制细胞活动 并且能够突变并保留突变。 这4点，缺一不可，如何建构一个DNA分子模型解释这一切？,DNA应该有什么样的结构，才能担当遗传的重任？,DNA双螺旋结构模型的主要依据 chargaff 规则 AT GC；A/TG/C=1 碱基的理化性质分析 AT GC 配对较为合理 DNA的

7、X衍射分析 DNA分子为线性双螺旋结构,DNA的碱基组成Chargaff规则 （1）同一生物体中，DNA 分子中碱基组成AT GC；A/TG/C=1，所以A+G=T+C（包括m5 C） ，即：嘌呤碱总和=嘧啶碱总和。 （2）有种的特异性，同种生物（各组织、器官）DNA 碱基组成相同，异种生物DNA碱基组成差异很大，可用不对称比率A+T/G+C 的相近程度表示种间亲缘关系的远近。 （3）DNA 碱基组成不受年龄，营养状况及环境的影响。（对维持物种的稳定性起很重要的作用）。,已知的核酸化学数据,威尔金斯 （Maurice Wilkins）,罗莎琳德富兰克林(Rosalind Franklin),沃

8、森（James Dewey Watson，1928-） 克里克（Francis Harry Compton Crick，19162004）,DNA双螺旋结构的发现,1951年 Watson 23岁 丹麦的哥本哈根 Wilkins教授 英国剑桥大学Cavendish实验室 Crick， 31岁 女科学家Franklin 伦敦大学Kings实验室 DNA应该是双螺旋 A与T、 C与G巧妙连接 符合X衍射数据 DNA的复制 1953年2月28日，Waterson 和Crick用金属线又制出了新的DNA模型，他们为自然科学树立了一座闪闪发光的里程碑。,剑桥的卡文迪什（Cavendish）实验室，在这里

9、，沃森和克里克发现了DNA结构。,DNA的结构，发表于自然171卷(1953)737-738页)上的插图,The Eagle Pub（老鹰酒吧） 在这里第一次宣布了他们的发现,（二） DNA双螺旋结构模型要点,1. 两条链反向平行，围绕同一中心轴构成右手双螺旋 (double helix)。螺旋直径2nm，表面有大沟和小沟。 2. 磷酸-脱氧核糖骨架位于螺旋外侧，碱基垂直于螺旋轴而伸入内侧。每圈螺旋含10个碱基对 (bp)，螺距为3.4nm。,3. 碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行,4. 两条链通过碱基间的氢键相连，A对T有两个氢键，C对G有三个氢键，这种A-T、C-G配对的规律，称为碱

10、基互补规则。,A、T配对,G、C配对,影响双螺旋结构稳定的因素 1）氢键 互补碱基对之间可形成氢键 2）碱基堆积力 电子云交错而形成的一种力，使双螺旋结构内部形成一个强大的疏水区，与介质中的水分子隔开，有利于互补碱基间形成氢键，稳定双螺旋结构。 3）离子键 磷酸基团上的负电荷与介质中的阳离子之间形成离子键（盐键）。 4）碱基分子内能 分子内部无规则运动形成的能量，受温度等外部因素的影响。,DNA 双螺旋结构的多态性 在多核苷酸链中，脱氧核糖的五元环能折叠成多种构象，此外，分子还可绕N-C糖苷键以及3,5-磷酸二酯键旋转一定的角度，这就使具有同样碱基配对的DNA双螺旋可以采取另一些构象，DNA构

11、象上这种差异称为多态性。 Watson和Crick所描述的DNA双螺旋构象现在称为B型DNA，另外还有A型、C型和Z型等构象类型的DNA，在一定条件下B-DNA可转变为A-DNA或C -DNA。,A-DNA： B型（湿度：92% DNA钠盐纤维的构象）DNA脱水时，就转变为A型（湿度：75% DNA钠盐纤维的构象）。A-DNA也是由反向的两条多核苷酸链组成右手螺旋。每一螺圈含11个碱基对，碱基对与中轴的倾角为20，两个核苷酸之间的夹角为33。RNA、DNA杂交双链以及RNA双螺旋区具有与A-DNA相似的结构。,Z-DNA： Rich在研究CGCGCG寡聚体结构时，发现CGCGCG有左手螺旋的双

12、螺旋结构，称之为左旋DNA。因为磷酸基在多核苷酸骨架上的分布呈“Z”字形，又称为Z-DNA。特点：直径1.8nm，螺距4.5nm，每一螺圈含12个碱基对，整个分子比较细长而伸展，大沟外凸而变得不明显，小沟则窄而深。,四种双螺旋结构的比较,三链DNA （tsDNA),三链DNA 多聚（dA）-多聚（dT）具有类似B-DNA的结构，提高其环境中的盐浓度（或降低相对湿度），它的双螺旋结构就歧化成三链结构和一条多聚脱氧核苷酸链。 DNA的三链结构可能与基因表达调控有关。第三股链的存在可能阻碍了一些调控蛋白或RNA聚合酶与DNA的结合。,三、DNA 的三级结构,在细胞中，由于DNA 与其它分子（如蛋白质

13、）的相互作用，使DNA 双螺旋进一步扭曲成环状或麻花状的形态，称为DNA 的三级结构。超螺旋是DNA三级结构的一种类型。,大肠杆菌质粒DNA的三级结构,（一）DNA的超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil) DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,意义 DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,（二）原核生物DNA的高级结构,（三）DNA在真核生物细胞核内

14、的组装,真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是 核小体(nucleosome)。,核小体的组成 DNA：约200bp 组蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4,真核生物的DNA与蛋白质结构形成核小体（2分子H2A、H2B、H3、H4和1分子H1 ）,串珠状核小体结构,串珠状核小体,DNA双螺旋片段,染色质纤维,伸展形染色质片段,密集形染色质片段,整个染色体,核小体,螺线管,真核生物染色体DNA组装,三、RNA 的结构,（一）RNA的基本结构 （二）tRNA的二级结构和三级结构 （三）rRNA的结构 （四）mRNA的结构,（一）RNA的基本结构,RNA为直线型多核苷酸链，链间也是以3,

15、5-磷酸二酯键彼此连接起来。 不同之处是RNA 的碱基组成没有DNA 那样的规律，大多数天然RNA 分子是一条单链，其可以发生分子自身回折，而使互补碱基区形成局部双螺旋区，不能配对的碱基区域则形成突环，形成类似发夹式结构。,（二）tRNA的二级结构和三级结构,tRNA的 二级结构,辨认并结合氨基酰tRNA合成酶,携带氨基酸,识别mRNA上的密码,识别并结合核蛋白体,tRNA的 三级结构,倒L型,tRNA三级 结构计算 机模拟图,内含子 (intron),* 真核生物mRNA成熟过程,外显子 (exon),（三）mRNA的结构,mRNA分子也是呈单链状态，大部分有突环形二级结构。 真核生物mRN

16、A：5-末端有一个特殊的帽子结构 m7GpppNmpN 3-末端有长约200核苷酸的polyA 原核生物mRNA：一般无3-polyA和5-帽子结构,mRNA结构特点,帽子结构作用： 1、 保护作用，抗核酸外切酶水解 2、 与蛋白质合成起始有关 3、 维持结构，协助核糖体与mRNA 结合,3polyA 作用： 1、 保护作用，抗核酸外切酶水解 2、 与mRNA 半寿期有关 3、与mRNA 转移有关,mRNA 5-帽子结构,m7GpppNmpN,原核生物mRNA 一般为多顺反子： 一条mRNA 编码多条多肽链。 真核生物mRNA 一般为单顺反子： 一条mRNA 编码一条多肽链。,（四）rRNA的

17、结构,rRNA的分子结构基本上都是由部分双螺旋与部分突环相间排列而成。,16S rRNA二级结构,* rRNA的功能 参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,核糖体的组成,(五 )其他小分子RNA及RNA组学,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA (small non-messenger RNAs，snmRNAs)。,snmRNAs,snmRNAs的种类 核内小RNA (snRNA) 核仁小RNA (snoRNA) 胞质小RNA (scRNA) 催化性小RNA 小片段干扰 RNA (siRNA),snmRNAs的功能 参与hnRN

18、A和rRNA的转录后加工和转运以及基因表达过程的调控等。,是研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能的科学。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。,RNA组学 (RNomics),第四节 核酸的理化性质及分离提纯,一、一般性质 二、紫外吸收性质 三、变性、复性与分子杂交 四、碱解与酸解 五、提取与分离,一、一般性质,提纯的DNA 为白色纤维状固体，RNA 为白色粉末，两者都微溶于水，不溶于一般有机溶剂。 DNA 分子由于直径小而长度大，因此溶液粘度极高，RNA 分子粘度则小得多。 溶液中的核酸在引力场中可以下沉，沉降速度与分子量和

19、分子构象有关。可用超速离心技术测定核酸的沉降常数和分子量。 核酸是两性电解质，（含碱性基团、 磷酸基团），因磷酸的酸性强，常表现酸性。由于核酸分子在一定酸度的缓冲液中带有电荷，因此可利用电泳进行分离和研究其特性。最常用的是凝胶电泳。（溴化乙锭、银染）,二、紫外吸收性质,核酸在260nm 附近有最大吸收值，是由碱基的共轭双键决定的。据此特性可定性和定量检测核酸和核苷酸。蛋白质在280nm 有一吸收峰，因此利用OD 260/O D280 比值可判断核酸样品的纯度。,纯DNA： OD260/OD280 值=1.8 纯RNA： OD260/OD280 值=2.0 当 OD260/OD280值1.8，含

20、RNA； OD260/OD280 值1.8 时，含蛋白质和苯酚。,RNA溶液的浓度（g/ ml）=OD260 40 DNA溶液的浓度（g/ ml）=OD260 50,减色效应,核酸的光吸收值常比其各核苷酸成分的光吸收值之和少3040%，这是在有规律的双螺旋结构中碱基紧密地堆积在一起造成的，此现象称为DNA 的减色效应。,1天然DNA 2变性DNA 3核苷酸总吸收值,三、变性、复性与分子杂交,（一）变性 1、变性的概念：,核酸的变性指核酸双螺旋的氢键断裂（不涉及共价键的断裂），变成单链，生物活性丧失的过程。,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,2、变性因素,热力、强酸、强碱、有机溶剂、变性剂（尿

21、素、甲醛）、射线、机械力等。,解链曲线：在连续加热DNA的过程中以温度对A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。,3、变性指标,（1）变性温度（Tm）,变性温度（Tm）,是指引起DNA 发生变性的温度变化范围的中点，又称熔点。变性作用发生在一个很窄的温度范围之内（爆发式的）。 Tm 也可以用吸光度值表示：热变性过程中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度。,Tm与下列因素有关,核酸的均一程度，均一性愈高的样品，变性过程的温度范围愈小。 Tm 值与GC 含量成正比： （G-C）%=(Tm-69.3)*2.44 Tm 值与介质离子强度成正比。,DNA的紫外吸收光谱,增色效

22、应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,（2）增色效应,（二）复性,变性DNA 在适当条件下，又可使彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，全过程称为复性。 DNA 复性后，许多理化性质、部分生物活性可得到恢复。但将热变性DNA 骤然降温时，DNA 不能复性，只有在缓慢冷却时，才可复性。,（三）分子杂交,不同来源的DNA 分子放在一起热变性，然后慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA 之间有互补或部分互补序列，则复性时会形成“杂交分子”。DNA 与互补的RNA 之间也可以发生杂交。 核酸的杂交在分子生物学和分子遗传学的研究中应用广泛，例：DNA 探针。,变性,复性,复性,核酸杂交的应用 Sou

23、thern blot (DNA印迹) 是英国的分子生物学家Southern 1975年发明的一种利用分子杂交原理鉴定DNA的方法.,Southern Blot 原理,基因组DNA限制性酶切琼脂糖凝胶电泳分离原位变性后转移到滤膜上用带有标记的核酸探针(已知序列)进行杂交检测与探针互补的DNA片段。,核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础,第五节 核酸与蛋白质的复合体,有机体内核酸常与蛋白质结合成复合体，称为核蛋白体。如 染色体 病毒 核糖体,1、染色体,核小体,2、病毒,3、核糖体,第六节 核

24、酸的分离和纯化,一、分离的一般原则 要保持天然性，因此要求在提取过程中掌握下列原则： 1、防止核酸酶的降解； 2、防止化学因素的降解； 3、防止物理因素的降解。,细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸,基本过程,机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。,细胞破碎,SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。,DNA

25、提取,蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖 提取液中加1PVP。,DNA纯化（去杂质）,将不同构象的DNA进行分离： 蔗糖密度梯度超离心大小不等的线性 DNA 分开，也可将分子量相同而构象不同的DNA分开； 氯化铯密度梯度平衡超离心双股DNA和单股DNA分开； 氯化铯-溴化乙锭梯度离心双链DNA的环状DNA和线状DNA分开。 羟基磷灰石（HA）或白蛋白硅藻土（MAK）柱层析分离变性DNA和天然DNA。,三、RNA的分离纯化,预处理：破碎细胞，获得RNP。RNP除蛋白的方法与DNP除蛋白的方法相似。RNA的提取多采用酚提取法。 进一步纯化多种方式：密度梯度离心、DEAE纤维素、DEAESephadex、甲基化白蛋白硅藻土等各种特异柱层析、特异亲和层析（分离mRNA)、免疫法（分离mRNA)等。聚丙烯酰胺凝胶电泳、羟基磷灰石柱层析、凝胶过滤法也常用于分离纯化RNA。,