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1、第三章 发酵工业的培养基及原料处理 一、发酵生产上使用的 培养基及要求 二、培养基的主要原料 三、原料的处理 四、培养基的灭菌,菌种筛选,摇瓶试验,发酵罐试验,放大试验,后处理,培养基是提供微生物生长、繁殖及代谢需要的营养基质，最主要是有利于积累大量的微生物产品。 培养基成分和配比合适与否，对微生物的生长、产品的生成、提取，甚至最后对成品的产量、质量都会产生相当大的影响。,根据生产工艺的不同，发酵生产上采用的培养基一般可分为斜面培养基、种子培养基和发酵培养基，而种子培养基有可以有摇瓶种子、固体孢子种子、一级种子、二级种子等。,一、发酵生产上使用的培养基及要求,1、斜面培养基： 斜面培养基是供菌
2、种繁殖、扩大之用，对这种培养基的要求是能够使菌体长得快而健壮，而且不易引起菌种变异。 一般斜面培养基中碳源和氮源含量不宜过多，特别是碳源，多了会引起pH波动，无机盐浓度也要控制适当，以免影响菌种特性。,2、孢子培养基： 供菌种繁殖孢子的一种固体培养基，要求使菌体生长迅速，产生数量较多的优质孢子，并且不引起菌种的变异，因此在配置上要求:,营养不能太丰富，否则不易产孢 无机盐浓度要适当，不然会影响孢子量和孢子的颜色(质量) 注意pH和湿度。,常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基等。 它们含氮量低，疏松、表面积大，是较好的产孢子培养基。,3、种子培养基： 有摇瓶种子
3、和种子罐用的种子培养基等。对种子培养要求做到纯种、健壮、活力旺盛，并有足够的数量，以满足下一级菌种生长繁殖需要。 因此，种子培养基要求营养物质适当的丰富和完全，培养基成分易于被菌体吸收，但浓度不宜过高，控制碳氮比，保持培养过程中pH稳定在适当范围内。 另外种子培养基的主要成分和培养条件应尽可能同发酵培养基保持一致，以缩短延迟期，使菌种迅速转入旺盛生长。,4、发酵培养基： 发酵培养基是要求最严格的培养基，它具有双重任务，一是供菌体生长繁殖，二是使菌种能够大量产生发酵产品。 因此发酵培养基的营养成分即要丰富和完全，又要求严格控制，尤其是那些对发酵产物的形成有严重影响的成分。,工业生产用培养基不同于
4、实验室，需要更多的考虑原料的来源与成本！,二、培养基的主要原料,碳源物质： 纯糖：葡萄糖、蔗糖 葡萄糖母液： 糖蜜：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜 淀粉、糊精等多糖：玉米淀粉、甘薯淀粉、 野生植物淀粉 纤维素、半纤维素类物质：秸秆 亚硫酸纸浆废液： 其它：油脂、有机酸、低级醇类等,氮源物质： 有机氮源： 豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆、鱼粉、蚕蛹粉、尿素等 无机氮源： 铵 盐：如硫酸铵(生理酸性盐) 硝酸盐：如硝酸钠(中性盐),无机盐：磷、硫、镁、钾、钙、铁、钠等元素一般以无机盐的形式加入。 微量元素：铜、锌、钴、锰、钼等微量元素一般在复合培养基中都存在，无需单独加入，某些特殊
5、需要的都是以无机盐的形式加入。 生长因子：一般在复合培养基中都存在无需单独加入。,实例： (一种抗生素的发酵培养基) 玉米淀粉： 100克 豆饼粉： 20克 酵母粉： 10克 硫酸铵： 0.25克 磷酸氢二钾： 0.1克 碳酸钙： 1克 微量元素混合液： 1ml 水： 1000ml pH：7.2(消前),实例： (谷氨酸发酵培养基) 水解糖： 1010.5 玉米浆： 0.30.55 磷酸氢二钠： 0.17 氯化钾： 0.03 硫酸镁： 0.06 pH：6.77.0 初尿： 1.82.0 流加： 0.81,三、原料的处理,原料处理的目的： 微生物工业的原料多采用一些天然的物质，它们大多是农副产品
6、或其它工业的下脚料，使用这些原料具有来源丰富、价格低廉，除含有丰富的碳氮源外，还有维生素和微量元素、具有一定的缓冲能力等，这些都是有利的方面。但是这些原料也有不利的方面，如：营养成分不完全明确，原料的来源不同、加工不同都会影响其品质，对生产上有一定的影响，因此需要根据具体的情况进行处理。,预处理： 粉碎、除杂、去壳、过筛等,淀粉质原料的处理： 目的：一些微生物缺乏淀粉酶，需要将淀粉质原料转化为短链糊精、寡糖、双糖或单糖后才能利用。,淀粉 水,调浆(1721),加0.50.8的HCl,pH 1.01.5,水解罐升温糖化,开始蒸汽压力0.30.5kg/cm2，进料完毕后升压至2.83.0kg/cm
7、2,保持1530分钟,水解糖液 （DE=9092%）,冷却至70,（一）、淀粉的酸水解： 酸水解速度快，常用于氨基酸、核苷酸发酵，工艺过程如下：,接下页,加NaOH中和至pH4.04.5,加0.1活性炭脱色(60),过滤,水解糖液,DE = 100,还原糖,干物质,（二）、淀粉酶法水解工艺过程：,淀粉 水,调浆(3540),加-淀粉酶,pH 6.0,加热保温液化 pH5.56.0 8090 3060分钟,加热灭酶 120，15分钟,升温灭酶，110 3060分钟,冷却至60，调pH4.55.0,添加糖化酶 60，4872小时,糖化液,糖液(DE=9092),淀粉的分解: 淀粉是葡萄糖通过糖苷键
8、连接而成的多糖类，淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉，前者是通过-(1,4)-糖苷键连接而成，后者是通过-(1,4)-糖苷键和-(1,6)-糖苷键连接的。,-淀粉酶： 又称液化酶，它对直链淀粉的作用是将直链的淀粉分子-(1,4)-键任意地、不规则的分解为若干短链的糊精，糊精继续分解，最后反应产物为13的葡萄糖及87麦芽糖，但是糊精变为糖的速度是极缓慢的。 -淀粉酶对支链淀粉的作用是将支链淀粉-(1,4)-键任意地、不规则地并能越过-(1,6)-键分解为若干短链，但不能分解其中的-(1,6)-键，最后产物为麦芽糖及少量糊精和葡萄糖。 淀粉受到-淀粉酶的作用后，醪液粘度降低，而且迅速地生成较多量的糊精，
9、故称为糊精化作用，或液化作用。,-淀粉酶： 外切型淀粉酶，它是从淀粉分子末端按两个葡萄糖单元切断糖苷键，因此直链淀粉受-淀粉酶的作用后生成麦芽糖。 支链淀粉在-(1,6)-键以前可以分解成麦芽糖，但不能切断-(1,6)-键，并且也不能越过-(1,6)-键，因此-淀粉酶作用于支链淀粉产物为麦芽糖和界限糊精。,糖化酶： 其它名有葡萄糖淀粉酶，直链淀粉受此酶作用后，每次切下一个葡萄糖单元，生成葡萄糖。 它对-(l,6)-键分解缓慢，但却能越过-(l,6)-键继续水解-(l,4)-键。,淀粉-l,6-葡萄糖苷酶： 也称异淀粉酶、R-酶，它能水解-(1,6)-糖苷键。,异淀粉酶,糖化酶,酸法糖化与酶法糖
10、化的比较,纤维质原料的处理： 结构： 葡萄糖以 -(1,4) -糖苷键连接形成的长链分子 1540根结晶和非结晶结构的纤维素长链分子形成原纤维 原纤维形成微纤维束 微纤维束集合形成纤维质 天然纤维质：5060纤维素、2124半纤维素、 1225木质素,纤维质物质的预处理： 物理法：,微粉碎处理 蒸煮和爆破处理 微波处理,纤维质物质的预处理： 化学法： 破坏纤维的结晶,碱处理、碱嗅氧、碱醇 醇酸、醋酐过氧化氢 Na2S,纤维质物质的预处理： 化学法： 脱木质素,硫酸盐法、亚硫酸盐法 二氧化硫气体处理 甲醇或乙醇盐酸、硫酸 丙酮酸,纤维的糖化处理： 酸法处理 酶法处理 其它原料的处理： 糖蜜、葡萄
11、糖母液等，主要是澄清、去杂、稀释等。,四、培养基的灭菌,分批灭菌：是指培养基在发酵罐中用蒸气加热，达到预定温度且维持一定时间，然后迅速将培养基冷却，并通入无菌空气保压，至接近发酵温度时接种。 分批灭菌适于规模小的工厂和种子罐，这种方法不需其它设备，操作简易，其缺点是加热和冷却所需时间较长，相对地说是延长发酵周期，使发酵罐的利用率降低。 另外大型发酵罐采用这种方法，不甚合理，因为发酵罐本身的夹套或蛇管传热面积有限，做不到高温度短时间的原则。,夹层或蛇管加热至90，开搅拌。 停搅拌，罐内进汽至要求的温度，维持12个小时。,连续灭菌：是将培养基在发酵罐外连续不断进行加热，维持和冷却，最后进入发酵罐。
12、 连续灭菌适合于大规模工厂，它的优点如下： (1)由于采用高温短时间灭菌，物料受热时间短，减少营养成分的破坏，有利于提高生产率。 (2)总的灭菌时间比分批灭菌大为减少，缩短发酵罐的生产周期。 (3)蒸气负荷均衡，提高了锅炉效率。 (4)适应于自动化控制。,连续灭菌的缺点： 1、易产生泡沫 2、大颗粒物料易造成管道堵塞 3、大颗粒物料会造成局部灭菌不彻底 4、需要增加设备,连续灭菌设备：,影响培养基灭菌的几个因素： 1、培养基中污染菌的数量,表：不同浓度肉毒梭菌(芽孢)在105下的灭菌时间,2、培养基的pH,表：pH 对微生物耐热性的影响,3、培养基的成份 培养基中含一定浓度的糖类、蛋白质及油脂
13、等，它们会增加微生物的耐热性，高浓度的有机物也增加了培养基的粘度，影响热的传入，应提高灭菌温度。 高浓度的盐类增加了渗透压，可以促进热的传导，降低微生物的耐热性，故易于灭菌。,4、培养基中的颗粒 培养基中的颗粒影响灭菌的效果，尤其是大颗粒和结块的颗粒传热效果差，所以灭菌前必须充分搅拌。有时需提高灭菌温度，延长灭菌时间来达到灭菌的要求。,5、泡沫 培养基在灭菌时产生的泡沫对灭菌效果有很大的影响，因为泡沫中的空气形成隔热层，空气的导热差，包裹在泡沫中的微生物就不容易被杀死(达不到受热的温度)。因此，灭菌操作中要注意泡沫的产生，要防止压力骤降而起泡。,思考题,名词解释 培养基 发酵培养基，分批灭菌，连续灭菌 简述题 简要说明发酵中使用的各种培养基及其要求 分析下述培养基各组分的作用及特点 玉米淀粉： 100克 豆饼粉： 20克 酵母粉： 10克 硫酸铵： 0.25克 磷酸氢二钾： 0.1克 碳酸钙： 1克 微量元素混合液： 1ml 水： 1000ml pH：7.2(消前) 简要比较酸法糖化与酶法糖化的优缺点 简要说明分批灭菌和连续灭菌的方法及特点 简要分析影响灭菌的因素及其在生产中的注意事项,