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1、第1章 氨基酸 (amino acid),1.1 氨基酸-蛋白质的构件分子,1.1.1 蛋白质的水解 蛋白质可以被酸、碱或蛋白酶催化水解。水解可分为完全水解和部分水解两种情况。,1.1.1.1 酸水解,一般用6mol/L HCl 或4 mol/L H2SO4回流20hr左右，蛋白质完全水解，不引起消旋，得到的是L-型氨基酸。但色氨酸完全被破坏，羟基氨基酸部分被分解，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。,1.1.1.2 碱水解,与5mol/L NaOH共煮10-20hr,完全水解，多数氨基酸不同程度的被破坏，得到的是L型和D型的混合物；精氨酸脱氨，但色氨酸稳定。,1.1.1.3 酶水解,不产生
2、消旋，不破坏氨基酸。部分水解。 胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin,糜蛋白酶)、胃蛋白酶(pepsin)。,1.1.2 -氨基酸的一般结构,-氨基酸除R基为氢（甘氨酸）之外，其-碳原子是一个手性碳原子，因此都具有旋光性。并且蛋白质中发现的氨基酸都是L型的。,1.2 氨基酸的分类,1.2.1 常见的蛋白质氨基酸 按R基的化学结构20种常见氨基酸可分为3类： 1. 脂肪族氨基酸 2. 芳香族氨基酸 3. 杂环族氨基酸,1.脂肪组氨基酸,a 中性氨基酸,甘氨酸（氨基乙酸）是唯一不含手性碳原子的氨基酸， 因此不具旋光性。,b 含羟基或硫氨基酸,c 酸性氨基酸及其酰胺,d
3、 碱性氨基酸,2 芳香族氨基酸,3 杂环族氨基酸,按R基的极性性质，20种常见氨基酸可分为以下4组：, 非极性R基氨基酸 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸 苯丙氨酸、色氨酸 甲硫氨酸 脯氨酸,不带电荷的极性R基氨基酸 丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸 天冬酰胺、谷氨酰胺 半胱氨酸 甘氨酸, 带正电荷的R基氨基酸 赖氨酸、精氨酸 组氨酸（唯一一个R基的pKa值在7附近的氨基酸）, 带负电荷的R基氨基酸 天冬氨酸、谷氨酸,氨基酸的简写符号(一),氨基酸的简写符号（二）,1.2.2 不常见的蛋白质氨基酸,1.2.3 非蛋白质氨基酸 除了参与蛋白质组成的20-30种氨基酸外，还有150多种其他氨基酸。 L型-氨
4、基酸的衍生物，也有些是-、-或-氨基酸，或D型氨基酸。,1.3 氨基酸的酸碱化学 1.3.1 氨基酸的兼性离子形式 氨基酸晶体、水溶液 中性分子形式：,晶体熔点很高，200以上；使水的介电常数升高。,1.3.2 氨基酸的解离,20种基本氨基酸，除组氨酸外，在生理pH下都没有明显的缓冲作用，因为其pKa都不在pH7附近。 组氨酸咪唑基的pKa值为6.0，在pH7附近，有明显的缓冲作用。,利用Handerson-Hasselalch公式，可算出在任一pH条件下一种氨基酸的各种离子的比例： 质子受体 pH = pKa + log - 质子供体,几种氨基酸的解离常数和等电点,1.3.2 氨基酸的等电点
5、（isoelectric point, pI）,对R侧链基不解离的氨基酸： pI = (pKa1+pKa2) 对R侧链解离的氨基酸 1.计算酸性氨基酸如天门冬氨酸。 2.计算碱性氨基酸如精氨酸。,1.3.4 氨基酸的甲醛滴定 滴定是定量分析的常用方法，甲醛滴定法原理：,3.4 氨基酸的化学反应,3.4.1 -氨基参加的反应 3.4.1.1 与亚硝酸反应,这是Van Slyke法测定氨基酸的基础。,3.4.1.2 与酰化试剂反应,这些酰化试剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护试剂。,3.4.1.3 烃基化反应,2，4-二硝基氟苯与氨基酸生成二硝基苯基氨基酸。被英国的Sanger用来鉴定多
6、肽蛋白质的N末端氨基酸。 称Sanger 试剂。,与苯异硫氰酸酯（PITC，Edman试剂）反应，Edman用来鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸。,3.4.1.4 形成西佛碱反应 3.4.1.5 脱氨基反应,3.4.2 -羧基参加的反应 3.4.2.1 成盐和成酯反应,3.4.2.2 成酰氯反应,这个反应可使氨基酸的羧基活化,3.4.2.3 脱羧基反应,3.4.3 -氨基和-羧基共同参加的反应 3.4.3.1 与茚三酮反应,3.4.4 侧链R基参加的反应 其中有些反应是蛋白质化学修饰的基础。,Pauly反应，可用于检测酪氨酸。,半胱氨酸侧链上的巯基（-SH），反应性能很高，在微碱性pH下，-SH基
7、发生解离形成硫醇阴离子（-CH2S-）。并可进一步与烷化剂反应生成稳定的烷基衍生物：,与乙撑亚胺反应,可用于序列测定(为胰蛋白酶提供了一个新位点)。 也可用来保护肽链上的SH基，以防止被重新氧化为二硫基。,胱氨酸中的二硫键在稳定蛋白质的构象上起很大的作用。氧化剂和还原剂都可打开二硫键。如过甲酸和巯基化合物,3.5 氨基酸的光学活性和光谱性质,3.5.1氨基酸的光学活性和立体化学 -氨基酸的-碳是一个不对称碳（手性碳），不对称碳原子上的4个取代基在空间的取向可以有两种构型，D型和L型。氨基酸的构型以D性甘油醛为参考物。,Thr、Leu、Pro和羟Pro还有第二个不对称碳原子。,3.5.2氨基酸的
8、光谱性质 3.5.2.1 紫外吸收光谱 常见的20种氨基酸在可见光区域都没有光吸收，在红外和远紫外区（200nm）都有光吸收.,芳香族氨基酸因为其R基含有苯环共轭键系统，故在近紫外区（200-400nm）有光吸收的能力. 蛋白质一般在280nm有最大光吸收，可用来测定蛋白质浓度。,分光光度法的原理是Lamber-Beer定律： A = log I0 /I = - log T = cl T= I/I0 A： 吸光值（absorbance） （光密度, optical density,OD） ： 摩尔吸收系数（摩尔消光系数） c： 摩尔浓度 l： 比色杯的内径或光程厚度 I0： 入射光强 I： 透
9、射光强 T： 透光率,3.6 氨基酸混合物的分析分离,要测定蛋白质的氨基酸组成或从蛋白质水解液中制取氨基酸，须对氨基酸进行分析分离。,3.6.1 分配层析法的一般原理 层析 即色层分析也称色谱(chromatography)。 层析的种类有很多种如吸附层析，离子交换层析等。 分配层析依据的是分配定律。,分配定律(partition law)：当一种物质在两种给定的互不相容的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡时，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数(Kd)。 Kd = CA/CB 某一物质在层析系统中的行为取决于有效分配系数 Keff = 某一物质在A相中的总量/某一物质在B相中的总量 溶
10、质的有效分配系数可以调整两项的体积比而加以改变。,分配层析的原理 （逆流分溶或逆流分配）：,3.6.2 分配柱层析,3.6.3 纸层析,3.6.4 薄层层析 将支持剂（硅胶、纤维素粉等）涂布在玻璃板上制成均匀的薄层。 分辨率高，所需样品极微，层析速度快。,3.6.5 离子交换层析,离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯苯二乙烯(polystyrenedivinylbenzene)等不溶性高分子化合物。聚苯乙烯苯二乙烯是离子交换树脂的基质(matrix)。 阳离子交换树脂，如SO3H（强酸型）或COOH（弱酸型），对于在酸性环境中的氨基酸阳离子，它们可以和H+发生交换而“结合”在树脂
11、上。 同样的阴离子交换树脂含有的碱性基团如N(CH3)3OH（强碱型）或）NH3OH（弱碱型）可解离出OH能与溶液里的阴离子交换而结合在树脂上。,分离氨基酸混合物经常使用强酸性离子交换树脂。 氨基酸在树脂上的牢固程度，主要取决于他们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用。 在pH3左右，氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电吸引力的大小次序是： 碱性氨基酸（A2+）中性氨基酸(A+)酸性氨基酸（A-）。 洗脱氨基酸的有效方法是 逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度（离子强度）。,氨基酸自动分析仪,3.6.6 气液层析 当层析系统的流动相为气体如氢，氦、氮，固定相为涂渍在固体颗粒表面
12、的液体时，称为气液层析或气液色谱(gasliquid chromatography)，简称气相层析或气相色谱。 待分析的样品被气化，气化了的样品将在流动的气相和固定的液体之间发生分配而被分离。被分开的组分和载气直接进入检测器。 气相层析法具有微量快速的优点，限制是要求样品能气化和热稳定性高。,3.6.7 高效液相层析 高效液相层析(high performance liquid chromatography，简称HPLC) 曾称高压液相层析(high pressure liquid chromatography)。特点是： 使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大； 溶剂系统采取高压，因此洗
13、脱速度增大。 多种类型的柱层析都可用HPLC来代替，例如分配层析、离子交换层析、吸附层析以及凝胶过滤。,作业（目的是复习，所以应认真自己做，并尽量做得全面仔细不应该应付）,1. 什么是蛋白质的酸水解、碱水解和酶水解，各有何特点？ 2. 写出20种基本氨基酸的结构、三字母缩写和单字母缩写。 3. 甘氨酸、组氨酸和脯氨酸各有何特点？ 4. 什么是氨基酸的等电点？写出下例氨基酸的结构、解 离过程，并计算等电点：缬氨酸、谷氨酸和精氨酸。 5. 在多肽的人工合成中，氨基酸的氨基需要保护，有哪些反 应可以保护氨基？ 6. Sanger试剂、 Edman试剂分别是什么？与氨基酸如何反 应，此反应有何意义？
14、7. 试写出半胱氨酸与乙撑亚胺的反应，此反应有何意义？ 8. 写出氧化剂和还原剂打开胱氨酸二硫键的反应。 9. 蛋白质有紫外吸收的原因是什么，最大吸收峰是多少？ 10. 什么是分配定律、分配系数？分配层析的原理是什么？ 11. 什么是HPLC? 12. 书上P156,15题。,第3章检测题,1. 写出下了列氨基酸的结构、解离过程，并计 算等电点：缬氨酸、谷氨酸和精氨酸。 2. Sanger试剂、 Edman试剂分别是什么？ 3.写出氧化剂和还原剂打开胱氨酸二硫键的 反应。 4. 什么是分配定律、分配系数？分配层析的原 理是什么？,2mmol/L 酸性缓冲液中含1mmol/L HA和1mmol/
15、L A-, pH=pK=5(K=10-5),若向一升缓冲液中加入0.5mmol/L 量的H+(假定缓冲液的体积仍是一升)， (a) 求A-和 HA的标准浓度和溶液的pH； (b) 假设HA的增加（A的减少）刚好 等 于加入的H+的量，计算A和 HA的浓 度和溶液的pH.,解：（a）设加入H+后有y量的 H+被 A-结合成HA,则 HA A- + H+ 加H+前 10-3 10-3 10-5 加H+后 10-3 +y 10-3 -y 10-5+0.510-3-y K=10-5 = H+ A-/ HA =10-5+0.510-3-y 10-3 -y/ 10-3 +y, y1=10.3910-4 = 1.04mmol/L(舍去), y2 = 4.81510-4 = 0.4815mmol/L 代入“加H+后”，可求出 A-， HA pH= pK+lg A-/ HA = 4.545,（b） pH= pK+lg A-/ HA = 4.523,氨基酸章完,