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1、第三章 吸附层析,第一节 概述,一、基本概念和色谱过程,1、概念 色谱法(Chromatography），也称色层法或层析法。此种方法基于混合液中各组分的分子极性、分子大小与形状、吸附力、亲和力等物理化学性质的差异，导致各组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，组分在两相间进行连续多次分配，从而彼此分离。 色谱不只是分离技术，也是一种分析方法。,2、色谱过程,3、色谱方法的共同特点： 色谱分离体系都有流动相和固定相两个相。 色谱过程中，流动相对固定相作连续的相对 运动。 被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。 4、样品在分离时的两个基本点： 混合
2、物中不同组分在柱内的差速迁移 同种组分在色谱体系迁移过程中分子分布离散,二、色谱法分类,1、按两相物理状态分类： 用气体作流动相气相色谱 用液体作流动相液相色谱 固定相可以是液体或固体，便可组合成四种主要色谱类型： 气固色谱（gas-solid chromatography,GSC ） 气液色谱（ gas-liquid chromatography ,GLC ） 液固色谱（liquid - solid chromatography ,LSC) 液液色谱（ liquid - liquid chromatography ,LLC,2、按固定相的形态分类,（1）柱层析 (column chromat
3、ography) 固定相装在柱内即为层析柱，根据层析柱的尺寸，结构和制备方法不同，分为填充柱层析和毛细管或开管柱层析。 （2）平板层析(planar chromatography) 固定相呈平板状，包括薄层层析、薄膜层析和纸层析。固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板、塑料板或有机薄膜上，或将固定相直接制成薄板状，称为薄层层析(TLC)；用滤纸作为固定相或固定相载体的层析为纸层析(PC)。,3、按分离过程物理化学原理分类,（1）吸附层析 (absorption chromatography) 用固体吸附剂作层析的固定相，利用样品各组分在吸附剂上吸附力的大小不同，而将各组分分离。如气固吸附层析和液固吸附层
4、析。 （2）分配层析 (partition chromatography) 用液体作固定相，样品组分（溶质）在固定相中溶解、吸附或吸着能力不同，因而在两相之间分配系数不同将样品组分分离。如气液分配层析，液液分配层析。在液液分配层析中，根据流动相和固定相对极性不同，又分为正相层析和反相层析。,正相分配层析 （ NPC) 一般以强极性、亲水性物质或溶液为固定相，非极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相，称正相层析。 反相分配层析 （ RPC) 以非极性、亲脂性物质或溶液为固定相，以极性、亲水性溶剂或水溶液为流动相，称反相层析。,（3）离子交换层析 ion-exchange chromatography
5、（4）凝胶层析 gel chromatography （5）亲和层析 affinity chromatography,三、层析法的优点,生物大分子的特点：有多样性，以复杂的形式（混合物、复合物）存在，对环境如温度、pH 条件、离子强度的要求较高。 用于研究的样品要求：一定的质和量，保存生物活性和严格的构象。 层析法的优点 1、在室温下操作 2、流动相的pH 值可以与生理液相似 选用含盐的缓冲溶液或与水互溶的有机溶剂,3、柱填料的表面经各种相应化学修饰和覆盖，为生物大分子的分离提供了温和的条件和 “软接触” ，利于保持其原有的构象和生理活性。 4、样品量可多可少，可用于制备和分析。,第二节 吸附
6、柱层析,一、常用术语 1. 固定相：层析基质 2. 流动相：洗脱剂、展层剂 3. 层析：样品在固定相和流动相中连续多次进行分配、吸附或交换作用，最终使各组分得到分离。 4. 操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。一般以每克基质结合某种成分的mmol数或mg数表示。,5. 床体积：膨胀后基质在层析柱中所占有的体 积（Vt）。 6. 洗脱体积：某一成分从柱顶部到底部的洗脱液 中出现，浓度达到最大值时流动相的体积。 7. 膨胀度：单位重量的基质充分溶胀后所占有的 体积（V）。 8. 分配系数和迁移率,外水体积 Vo,洗脱体积 Ve,固定相,层析床,二、基本原理
7、,生物大分子在层析柱中与吸附剂颗粒的表面吸附位点以范德华引力、静电引力进行可逆性结合,在洗脱剂（流动相）的作用下，通过吸附解吸附再吸附再解吸附的连续历程，依据各成份与吸附剂结合力之间的差异而达到分离。,影响吸附层析分离效果的因素,吸附剂的性质 洗脱剂的性质 层析柱及装填技术 对样品的要求 加样方式及加样量 柱效,三、吸附剂的选择,选择性好 对不同物质的吸附力差异性大 表面积大 增加吸附容量 性质稳定 不与被分离物、洗脱剂及溶剂发生化学反应；不分解不破坏被分离物；在一定范围的酸碱度、一定的操作压时不变形，不破碎。 颗粒均匀、表面积大 成本低廉,1、选择原则,2、常用吸附剂的特点 羟基磷灰石：性质
8、稳定、吸附容量大、适用范围广 硅胶：化学惰性、吸附容量大、活性程度与其含水量关系密切（含水量高，活性小） 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。为便于解吸附，在分离极性大的物质时应选择极性小的吸附剂。,四、溶剂与洗脱剂,溶剂：溶解样品的溶液 洗脱液：洗脱吸附柱的溶液 选择时，从样品组分的溶解度、吸附剂的性质、溶剂的极性方面考虑。极性大的洗脱能力大，因此可先用极性小的作溶剂，使组分易被吸附，然后换用极性大的溶剂作洗脱剂，使组分易从吸附柱中洗出。,1、概念,2、选择洗脱剂的原则,性质稳定：不改变吸附剂的性质，如溶胀或收缩 纯度高：防止流动相中的杂质在吸附柱上积累形 成
9、的污染 能较完全洗脱下所分离的成分 低粘度：高粘度时降低溶质扩散、增加柱压，降 低效率 样品容易回收 无吸收背景：提高检测的灵敏度,五、层析柱及装填技术,1、层析柱 吸附层析柱一般 d:h 1:101:40 2、吸附剂用量 为分离样品的 30 50 倍 3、柱子的装填 干装与湿装,六、层析样品的要求,样品的溶解度好 加入的样品量利于提高分辨率 加样量 Vt Vt。 样品的浓度与粘度的考虑,2,10,1,1,注意：加样时避免冲动基质,七、洗脱,1、原理 溶解（解吸附），吸附，再溶解，再吸附，被吸附的物质解吸并随洗脱剂向前移动，又吸附到新的吸附剂上，再被洗脱剂解吸，如此反复，各组分吸附能力及溶解能
10、力的差别导致移动距离的差异，使各种成份形成各自的区带，样品得以分离及纯化。若分离物是有色的，便看见色谱层。,2、流速与分离效果,流速太慢，前峰拖尾与后峰相连,流速太快，组分分不开,正常的流速使组分完全分离,装填层析柱 柱的平衡 加样 洗脱 收集 测定 绘制洗脱曲线 合并有效成份 计算含量（酶活力） 基质的再生,八、操作程序,第二节 薄层层析,一、原理： 将吸附剂在玻璃或涤纶胶片片基上均匀涂布成薄膜或薄板，经过活化后，即可对样品进行展层，达到分离、纯化、制备、分析鉴定的目的。 二、优点： 1、展层时间短 2、设备简单、操作方便 3、干扰因素小 4、显色方便 5、灵敏度高,三、操作及注意事项,1、
11、吸附剂的选择 硅胶：略带酸性，适合于酸性和中性物质的分离。 氧化铝：微碱性，适合于碱性和中性物质的分离。 2、薄层板的制备 （1）薄层的厚度与 Rf 值 薄层厚度200M，Rf基本不变 （2）薄层的活化 100oC,1h,硅胶薄层薄板的活性测定,苏丹黄、苏丹红、靛酚蓝在活化的薄层薄板上的层析行为,A B C D,（3）薄层的活性测定,3、样品的要求 （1）样品的浓度 1-5mg/ml （2）样品的纯度 不含盐 （3）样品与吸附剂的作用 （4）样品的溶剂 使用挥发性有机溶剂,4、展层剂的选择,（1）种类 单一溶剂、混合溶剂 （2）要求 使样品组分很好地溶解 与样品不发生化学反应 将混合样品较好分
12、离 易挥发、粘度小、组成简单 临时新配，只使用一次 展层剂的极性 在同一支持介质上，溶剂极性愈大，对同一化合物的洗脱能力也愈大，即在薄板上被推进得愈远，Rf值愈大。,不同展层剂对物质的分离影响,咖啡酸与绿原酸在极性不同的展层剂中的分离效果,特异性显色剂 紫外光、荧光显色 薄板中含荧光素 腐蚀性显色剂,6、显色,5、展层装置与展层过程,（1）使用适当的装置,（2）装置的饱和度对展层的影响,6、操作程序,1、制备薄层板 2、点样：点样斑点小，点样量适当 3、展层 4、显色,第三节 聚酰胺薄膜层析,一、基本原理 聚酰胺是由己二酸与己二胺合成的、含有大量酰胺基团的化学聚合体。它与许多物质通过形成氢键的
13、方式结合，氢键的强弱决定被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附力的大小。选择适当的展层剂使被分离物在聚酰胺薄膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，导致被分离物分离。,二、应用 1、蛋白质 N 末端的 DNS 分析技术,DNS-蛋白质DNS-肽,荧光试剂（ DNS-CL ） +蛋白质（肽）,酸解,pH2-2.5,抽提,DNS-N 末端氨基酸,层 析,显 色,分析,丹磺酰氯与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物，也常用于多肽链的N末端氨基酸的鉴定。,2、蛋白质的氨基酸组成分析程序,蛋白质在盐酸中水解110，1824小时,中和,DNS-Cl,调pH9-10.5,盐酸调PH 23，乙酸乙酯抽提,DNS-氨基酸层析,