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1、专题2 细胞工程,2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体,植物体细胞杂交的意义：,打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种。,一、动物细胞融合,细胞融合是正常的生命活动。,(一)动物细胞融合的概念,动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,（二）动物细胞融合的过程,与植物原生质体融合原理相同，方法类似。,杂交细胞:融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法 化学法,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面,细胞膜被病毒颗粒穿通,细胞膜连接,细胞融合，形成杂种细胞 （细胞膜
2、具有一定的流动性）,两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的,为什么灭活的病毒能作为诱导剂？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。,不灭活的病毒能作为诱导剂吗？,不能，因为不灭活的病毒会感染细胞。,动物细胞融合技术的发展简史,(三)动物细胞融合的应用,1.突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能。,2.成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。,3.为制造单克隆抗体开辟了新途径。,鼠鸡、鼠兔、鼠猴、人鼠、人兔、 人鸡、人蛙、酵母菌鸡 、人胡萝卜等,主要用于制备单克隆抗体,获得杂种植株,用途,物理、化学方法（同左）,灭活
3、的病毒,物理（离心、振动、电激） 化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后诱导细胞融合,去除细胞壁后诱导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、植物细胞全能性,原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较,二、单克隆抗体,什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 B淋巴细胞（浆细胞）能产生抗体。,（一）获得抗体的传统方法,1、把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需的抗体。,2、缺点： 产量低，纯度低，特异性差。,人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B淋巴细胞
4、可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每一个B细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。,1、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念,用单个B淋巴细胞进行克隆，得到的细胞群能够分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。,2、怎样才能获得单克隆抗体？,提示1：仅用细胞培养技术可行吗？,提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？,提示3：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？,如何大量生产单克隆抗体？,利用B淋巴细胞产生抗体的功能。 利用肿瘤细胞无限增殖的特性。 利用细胞融合的技术将两种细胞融合获
5、得具有B淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞。 利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。,（二）单克隆抗体的制备,整个制备过程为何要经过两次筛选?,第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞,第二次筛选（克隆化培养和抗体检测）：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？,融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清
6、液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下，培养得到的细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。,杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。,单克隆抗体的概念： 由单个杂交瘤细胞进行无性繁殖,也就是通过克隆，形成细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异
7、性强的抗体称为单克隆抗体。,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？,就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。,我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和
8、一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。,（三）单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，单克隆抗体特异性强，灵敏度高，并可大量制备。,应用主要有：,1、作为诊断试剂,2、用于治疗疾病和运载药物,准确、高效、简易、快速,把抗癌细胞的单克隆抗体与药物相结合，制成“生物导弹”。,资料： 目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶
9、”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,思考与探究,1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？,植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。,2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？,哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，
10、但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。,1在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（ ） A结果是相同的 B杂种细胞的形成过程基本相同 C操作过程中酶的作用相同 D诱导融合的手段相同,2. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞 诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在 这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ） 淋巴细胞 小鼠骨髓瘤细胞 B淋巴细胞自身融合细胞 小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞 A B C D,C,