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1、细胞骨架组分的 荧光染色观察,实验目的,掌握细胞骨架的显示方法 掌握荧光显微镜的使用方法 了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构,背景知识,常用荧光探针介绍,狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。 广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。,细胞骨架,2019/6/20,微管,2019/6/20,微丝,2019/6/20,中间纤维,背景知识,S.D.Pone用考马斯亮蓝染人皮肤成纤维细胞的细胞骨架获得成功。1982年上海植物生理所陈梓卿采用植物细胞为材料也获成功。实践证明这是一种简单易行的方法。 当细胞用适当浓度的triton X -100溶液（聚乙二醇
2、辛基苯基醚，一种非离子去垢剂）处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而微丝束结合得比较紧密，不容易被去除 ，经固定和染色后，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。,细胞骨架研究中常用药物,实验原理,鬼笔环肽(phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。 由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白, 因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响. 此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用. 因此, 用鬼笔环肽标记微丝并不
3、是用于研究活体细胞的理想方法.,G-actin,F-actin,ATP、 Mg2+、高K+、Na+,Ca2+、低Na+、K+,实验步骤,材料： CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞 试剂： 1.PEM：50mM pipes (pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 2.0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液中。 3.4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。,取出盖片，于小平皿中37预温 PEM洗3次(每次 1mL),Triton X-100处理约10min(1mL),37预温 PEM洗3次(每次 1mL),37预温 4%多聚甲醛固定细胞15mi
4、n (1mL),37预温 PEM洗3次,55nM Alex -phalloidin 10L湿盒中室温染色30min。,37预温 PEM洗数3次,滴加10L Ho.33342复染色,用小砂轮切去长方形盖玻片的一角作为标记以便识别细胞面。 细胞密度60-80%,注意盖玻片的正反面,切勿产生气泡！,在parafilm 膜上加PEM ，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。,避光操作,荧光镜下观察,注意事项,注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面； 各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落； 荧光观察注意避光操作 节约试剂。,思考题,PEM缓冲液的作用是什么？ 0.5%Triton X-100处理细胞的作用是什么？ 鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？,