作业-生物检测技术.ppt

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1、,生物技术与食品安全和品质控制,第1节 生物传感器及其在食品检测中的应用 第2节 免疫学技术与食品安全检测 第3节 分子生物学技术及其在食品安全检测中的应用 第4节 生物芯片及其食品安全检测中的应用,一、生物传感器的基本概念 （一）生物传感器的定义 传感器 一种把一种信号转换成另一种信号以实现信号检测的元器件.由固定化的具有分子识别功能的生物材料、换能器和信号处理放大装置组成的分析工具或系统。 被转换的信号通常包括磁、力、热、光、电、化学，这些信号可以转换成声、光、电等信号以便分析和检测。,第1节 生物传感器及其在食品检测中的应用,从传感器对不同能量进行变换的功能分类： 光（辐射）传感器 磁传

2、感器 力（压力和加速度）传感器 温度传感器 化学传感器,物理传感器,生物传感器（biosensor） 以传感器为基础，由生物学、电化学、光学、热力学及计算机等学科相互渗透和融合的产物，是多学科的交叉领域。 属于化学传感器的范围,生物传感器的基本组成单位： 生物敏感元件/生物识别元件 (biological sensing element) 是酶、抗原（体）和微生物细胞等具有分子识别能力的生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力,换能器/转换器（transducer） 能将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并且在一定条件

3、下，产生的电信号强度和反应中物质的变化量呈现一定的比例关系,信号处理放大装置 （singal ampligication system） 能将换能器产生的电信号进行处理、放大和输出。,（二）生物传感器的基本组成和分类 1 生物传感器的基本组成,被测物,生物识别元件 换能器,识别部位,电信号,信号处理装置,2 生物传感器的分类,酶传感器 微生物传感器 免疫传感器 细胞器传感器 细胞传感器 组织传感器 DNA传感器,生物敏感材料,电化学生物传感器 介体生物传感器 测光型生物传感器 测热型生物传感器 半导体生物传感器 压电晶体生物传感器,换能器不同,二 生物传感器的基本原理 （一）生物传感器的反应基

4、础及分子识别机理 生物敏感材料中生物分子能选择性的和待测样品中的待测成分进行特异性结合的性质 包括酶、抗原、微生物细胞、组织切片、DNA等,通过生物的分子识别作用，生物传感器中的生物敏感材料和生物样品中的待测物质特异性结合，并进行生物化学反应，产生离子、质子和质量变化等信号，信号的大小在一定条件下和样品中被测物质的量存在一定的关系，这些信号经换能器转换成电信号，电信号再经信号分析处理系统处理后输出，反映出样品中被测物质的量。,生物传感器模型,生物传感器原理图,分子识别（molecular recognition） 指生物敏感材料中生物分子能选择性地和待测样品中的待测成分进行特异性（选择性）结合

5、的性质。生物敏感材料包括酶、抗原（体）等免疫物质、微生物细胞和DNA等。,酶的分子识别:指酶分子只能和特定的底物分子进行结合，而不能和其他分子结合的特性。酶分子的识别能力主要是由酶的活性中心决定，其决定了以酶为生物敏感材料的生物传感器的分子识别能力。 免疫传感器的分子识别：由传感器上的生物敏感材料抗原或抗体物质的分子识别能力决定，抗原和抗体象酶和底物一样也能发生特异性（选择性）结合。 DNA传感器的分子识别：由DNA分子中碱基对的互补结合特性决定。,1 酶促反应 E+SES P+E E:酶 S:底物 ES:中间络合物 P:反应产物,免疫化学反应 Ag+Ab=AgAb Ag：抗原 Ab：抗体,3

6、 微生物反应 利用微生物作为天然的生物催化剂进行的反应。 微生物细胞是一个极其复杂的、完整的生命系统，数以千计的酶在系统中高度协调地行使其功能。,微生物细胞的膜系统为酶反应提供了天然的适宜环境，细胞可以在相当长的时间内保持一定的催化活性 在多底物反应时，微生物比单纯酶更适宜作催化剂 细胞本身能提供酶促反应所埯的各种辅酶和辅基 微生物细胞比酶的来源更方便，价格低,生物学反应中的物理量变化 热焓变化 生物发光 颜色反应 阻抗变化 直接产生电信号,（四）生物传感器的特点,(1)根据生物反应的特异性和多样性,理论上可以制成测定所有生物物质的传感器,因而测定范围广泛。 (2)一般不需进行样品的预处理,它

7、利用本身具备的优异选择性把样品中被测组分的分离和检测统一为一体，测定时一般不需另加其他试剂,使测定过程简便迅速,容易实现自动分析。 (3)体积小、响应快、样品用量少,可以实现连续在位检测。,(4)通常其敏感材料是固定化生物元件,可反复多次使用 (5)准确度高,一般相对误差可达到1%以内 (6)可进行活体分析 (7)传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪,因而便于推广普及 (8)有的微生物传感器能可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生，能得到许多复杂的物理化学传感器综合作用才能获得的信息。,三、生物传感器在食品工业中的应用 （一）农药和抗生素残留的分析 乙酰胆碱酯场效应管传感器，用

8、于分析敌敌畏等有机磷农药的残留 乙酰胆碱酯酶能催化乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，当存在有机磷农药残留时，能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使胆碱和乙酸的产生减少，且在一定条件下，乙酸的减少量和有机磷农药的量之间存在一定的比例关系， 乙酸的减少量可以通过离子场效应管来测定,（二）抗生素残留的分析 青霉素和磺胺是兽药中常用的抗生素，其残留会污染动物性食品，从而对人类的健康造成危害。 采用免疫传感器测定了牛奶中硫胺二甲嘧啶的含量，灵敏度达到1ngg，传感器表面经NaOH和HCl处理后可以重复使用。 用抗体酶共轭物为敏感材料结合光度分析法检测了牛奶中青霉素的含量。,（三）食品添加剂的分析 亚硫酸盐是常用的食品防

9、腐剂和漂白剂，但是亚硫酸盐容易引起哮喘，美国FDA规定了其在新鲜水果和蔬菜等食品中的含量不得超过110-6molL。 天冬酰苯丙氨酸甲酯，又称甜味素，是人工合成的低热量甜味剂。 烟碱酸属于B族维生素，可以作为肉类食品的发色剂，但是人体摄入过量的烟碱酸会引起瘙痒和头痛等中毒症状，在日本已禁止使用。 其他食品添加剂，如防腐剂苯甲酸钠、羟基苯甲酸钠、过氧化氢，抗氧化剂抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、儿茶酚、儿茶酚胺，发色剂亚硝酸，酸味剂磷酸和乳酸等都可以用相应的生物传感器来检测它们在食品中的含量。,（四）污染微生物的检测 利用微生物在代谢过程中产生电子，电子直接在阳极上放电产生电流，通过测定电流大小 从而测

10、定微生物浓度的传感器 检测酿酒酵母、乳酸菌 病原菌,污染食品的微生物可以分为腐败菌和病原菌。腐败菌主要是通过对食品成分的分解和破坏，同时产生有毒有害物质从而对人体造成危害。腐败菌本身通常不是致病菌。病原菌除了能破坏食品的组成成分外，其菌体本身也能使人致病。 食品中污染微生物的检测方法通常是平板计数法，其操作繁琐，检测时间长，特别是对于病原菌的检测，有时长达l-2周才能出结果，因此各种快速检测方法不断涌现，生物传感器检测方法就是其中的一种。,1.腐败菌的检测 酿酒酵母、乳酸菌和枯草芽孢杆菌等是常见的食品腐败菌。 2.病原菌的检测 常见的污染食品的病原菌有沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特

11、氏菌、产气荚膜梭菌和蜡样芽孢杆菌等。这些病原菌按常规的检测方法检测时间很长，而采用生物传感器则能迅速地测定它们的数量。 用来测定病原菌的生物传感器主要是光纤生物传感器、免疫生物传感器和DNA生物传感器。 目前，上述病原菌都可以用相应的生物传感器来测定。,（五）生物毒素的检测 细菌毒素:由细胞分泌产生于细胞外或存在于细胞内的致病性物质 真菌毒素：真菌分泌产生的有毒次生代谢产物,污染食品的生物毒素主要包括细菌毒素、真菌毒素、藻类毒素以及动植物毒素，其中以细菌毒素和真菌毒素最为常见。 检测毒素的方法包括色谱法（气相色谱、液相色谱、薄层层析等）和生物学方法等，这些方法检测时间长，对样品的前处理复杂繁琐

12、。以免疫学方法和生物传感器检测方法为代表的各种快速方法备受欢迎。,（六）食品新鲜度的分析 利用鱼死亡后，鱼肉中ATP分解代谢后各种代谢产物之间的比例关系做成生物传感器 肉鲜度传感器：单胺氧化酶固定于氧电极 牛乳鲜度传感器：牛乳中的微生物数量，乳酸增加量，或牛乳中的脂肪分解成的短脂肪酸的量来评价,第2节 免疫学技术与食品安全检测,一、常用的免疫学方法 以抗原抗体特异性结合为基础发展起来的，这种特异结合可以发生在生物体内也可以发生在体外，用于食品卫生和安全检测的都是体外反应，必须使用含有特异性抗体的血清，又称为血清学反应或血清学方法。,根据给出的检测结果是定性的还是定量的，免疫学方法（血清学方法）

13、可以分为定性免疫学方法和定量免疫学方法。 定性免疫学方法：能给出分析样品中是否含有某种特定的抗原或抗体，或者特定抗原或抗体的含量是否高于或低于某一数值。 定量免疫学方法：能给出样品中特定的抗原或抗体的准确数量。,（一）酶免疫分析（EIA） 抗原（抗体）被酶标记后与相应的抗体（抗原）反应，通过测定酶催化反应的产物量来计算抗原抗体的结合量，进而计算出待检测物质（抗原或抗体）量的方法。,（二）酶联免疫吸附方法（ELISA） 酶标板为载体，在适当条件下使抗原或抗体上包被或吸附在酶标记板微孔的内壁上成为固相抗原或抗体，没有被吸附的被洗涤除去，然后加入酶标记抗体或抗原形成酶标记的抗得抗体复合物固定在微孔或

14、试管上,（三）免疫沉淀反应 将可溶抗原与相应抗体在适量的电解质存在的条件下发生特异性结合，形成抗原抗体复合物并出现肉眼可见的沉淀 ，这种沉淀只有在抗原抗体比例适合时才能形成。,（四）免疫凝集反应 颗粒抗原（细菌、血红细胞）或可溶性抗原（抗体）结合于不溶性的载体微粒上后与相应的抗体（抗原）在适当的条件下，经一定时间后凝集成肉眼可见的凝聚物的反应,二、免疫技术在食品安全检测中的应用 （一）在食品污染细菌及其毒素检测方面 沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、气单胞菌、霍乱弧菌,（二）食品中污染真菌及其毒素的免疫分析 地菌属、根霉属、青霉属、曲霉属、毛霉属、分枝霉属、腐质霉属等,（三）食品中农药残留的

15、免疫学方法检测,食品中的农药残留包括除草剂残留、有机磷、有机氯和氨基甲酸酯类等杀虫剂的残留。目前农药残留的检测手段主要是毛细管气相色谱和高效液相色谱及其联用技术。 免疫学方法用于食品中农药残留检测和分析的研究大约开始于十多年前。由于具有快速、灵敏、特异、操作简便、无须昂贵的仪器设备和可以在采样现场分析等优点，已成为当今农药残留检测技术的主要发展方向之一，越来越受到人们的重视。,（四）食品中抗生素残留的免疫检测 农用抗生素、畜用抗生素,（五）食品中掺假物的免疫学识别 绵羊奶或山羊奶奶酪的生产中，掺杂有牛奶成分将影响绵羊（山羊）奶奶酪的品质和加工特性，因此在加工过程中应避免牛奶的掺入。,（六）免疫

16、学方法在分析样品净化中的应用 抗黄曲霉毒素、伏马素等的抗体包被在葡萄糖凝胶或琼脂凝胶颗粒上，形成免疫亲和层析柱,第3节 分子生物学技术及其在 食品安全检测中的应用,（一）分子杂交技术,核酸的分子杂交,液相杂交,固相杂交,原位杂交,膜杂交,斑点印迹杂交 Souther杂交 Northern杂交,膜杂交：,(二)PCR技术 不对称PCR 两引物浓度不同，经过若于轮循环，低浓度的引物被用尽，产生大量由高浓度引物引导产生的单链DNA，可以作为探针或DNA测序的核酸,多重PCR 同一反应中采用多对 引物对基因的不同片 段同时扩增，可以同 时扩增多个DNA片段,巢式PCR 采用两对引物，一对在DNA外侧，

17、为外引物，另一对在内侧，称为内引物，实现对模板DNA含量很少的样品的分析和检测,外引物,外引物,内引物,内引物,锚定PCR 只知道DNA片段一端的序列 在基因未知端添加已知的 PolyA尾，人为的赋予基 因未知末端特定的序列,（三）在食品安全检测中的应用 样品前处理 靶微生物的富集： 培养增殖法采用特定的选择性培养基通过培养增殖的方式来提高样品中的靶微生物数量，还可以降低样品中PCR抑制剂的浓度以利于靶DNA的PCR扩增,PCR抑制剂的去除：,靶微生物的富集培养、凝胶过滤 土壤样品中微量的腐殖酸对PCR的抑制采用凝胶过滤,2 食品中污染微生物的分子生物学技术检测 细菌：亲水气单胞菌、肉毒梭菌=

18、肠道 致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌 病毒：轮状病毒、肝炎病毒、肠病毒 寄生虫、隐孢球虫、内阿米巴虫、梨形鞭毛虫,第四节 生物芯片及其在食品安全检测 中的应用,（一）生物芯片 按预先的设置排列固定有大量生物识别分子（例如DNA片段、RNA片段、抗原抗体分子或蛋白质、肽分子）的面积很小的载体（硅片、载玻片等） 将待测样品加在芯片表面，由于生物分子牧民性亲和反应，检测样品中的待检测成分分别和芯片上固定化的生物识别分子结合反应，从而实现对样品的分析和检测,分类： DNA芯片、蛋白质（肽）芯片,DNA芯片的制备方法： 1、芯片制备 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成

19、和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。,2、样品制备 生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。,3、杂交反应 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。,4、信号检测和结果分析 杂交反应后的

20、芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。 基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统,（二）、生物芯片的应用 1、DNA芯片应用 DNA序列测定 将未知序列的单链DNA片段和DNA芯片进行杂交，互补序列形成双链，通过分析鉴定双链体的情况可以得出未知DNA的序列,DNA多态性的分析 检测生物群体中，个体间基因核酸序列的差异。 采用等位基因特异性的DNA探针固定在玻璃片上形成DNA芯片，采用PCR技术扩增待检测的基因组的DNA，得到荧光樗的单链DNA片段，将其与DN

21、A芯片杂交，最后得到多态性的分析,DNA突变检测 表达分析,2、蛋白质芯片的应用 2000年9月，science，蛋白质芯片研究蛋白质之间以及蛋白质与小分子之间的相互作用。 用于制备无烟煤各种蛋白质溶液中加入甘油，以防止蛋白变性，将蛋白质直接点接于载体膜上并固定化，之后以牛血清白蛋白进行封闭，降低膜上的背景，即得到蛋白质芯片。,2001年，science，将酿酒酵母5800个基因克隆并表达产生对应的蛋白质，分离纯化这些蛋白质，将它们固定于载体膜上得到蛋白质芯片 应用时将其他蛋白质或小分子物质与芯片进行反应，可以分析蛋白质之间或蛋白质与小分子之间的相互作用。,3、生物芯片在食品安全检测中应用的前景 食品中毒事件的调查 食品污染生物毒素的检测 食品中污染病原菌的检测 食品中残留农药和抗生素的分析,Thank you!,