基因工程载体32.ppt

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1、第二章 基因工程载体,vectors,1. 基因工程载体的概念,把一个有用的基因（目的基因研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫载体。作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。,T vector的克隆过程,A,A,T,T,T vector,PCR product,T4 DNA ligase,A,A,（1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。,（3）有一段多克隆位点。,2. 基因工程对载体的要求,外源DNA插入其中不影响载体的复制。,（4）分子量小，拷贝数多。,

2、3. 载体的种类,按工作方式: 质粒载体、噬菌体载体。 按功能: 克隆载体和表达载体。 按受体细胞: 原核细胞（大肠杆菌的克隆载体）和真核细胞的克隆载体。,第一节 质粒载体,一、质粒（plasmid）,是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。,存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。,（1）分子量小：,1200 kb,（2）编码基因少：,23个中等大小的蛋白质。,（3）环形状：,双链环状DNA。,（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。,如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。,1. 质粒的一般生物学特性,（4）质粒的空间构型：, 共价闭合环状DNA（cccDNA),

3、呈超螺旋（SC）（super coil）,Covalent close circular DNA, 线形DNA （ linear ，lDNA）,一条链上有一至数个缺口。, 开环DNA（ open circular， ocDNA）,（5）质粒空间构型与电泳速率,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：,scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。,SC,OC,L,二、质粒的类型,在大肠杆菌中的质粒，可以分为：,接合型质粒（conjugative plasmid),非接合型质粒（non-conjugative plasmid),能自我转移,不能自我转移,除了带有自我复制所必需的遗传信

4、息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。,如：F质粒（性质粒、或F因子）：,又叫自我转移型质粒。,1. 接合型质粒：,不符合基因工程的安全要求。,大肠杆菌接合（conjunction）,2. 非接合型质粒：,虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。,（1）R质粒（抗性质粒）：,带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。,符合基因工程的安全要求。,带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。,（2）Col质粒：,大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。,Col质粒或R

5、质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。,三、质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性) 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存，这一现象称为质粒的不相容性,又称质粒的不亲和性。,三、质粒载体的构建,1.质粒载体的发展概况,第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量(降低载体长度)，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含

6、T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,三、质粒载体的构建,2. 质粒的命名,用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。 如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。,分子量大，拷贝数低,三、质粒载体的构建,3. 天然质粒的局限性,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。,但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。,（1） 具有复制起点（ORI）,4. 质

7、粒载体必须具备的基本条件,（2）具有抗菌素抗性基因,（3）若干限制性内切酶的单一位点：,是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。,用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。,（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。,当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。,不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。,抗菌素选择原理,活,死,抗性基因,抗菌素,四、经典的大肠杆菌质粒载体,1. pSC101,第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。,（1）类型,天然质粒，属低拷贝型。,（2）长度,9.09 kb。,（3）选择标记,四环素抗性Tetr

8、,有Hind 、EcoR、BamH 、Sal 、Xho 、Pvu、 Sma 7种核酸内切限制酶酶切位点，其中在Hind 、 BamH 、 Sma 3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr 基因失活。是第一个真核生物的克隆载体。,（4）克隆位点,pSP2124质粒的Ampr基因,2. pBR322：,（1）元件来源,F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。, 复制起点 ori,pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点, Ampr基因, Tetr基因,pSC101的Tetr 基因。,（2）长度,4363bp,（3）选择标记,氨苄青霉素和四环素抗性。,（4）克隆位点

9、,其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。,24个克隆位点。,（5）pBR322的优点, 双抗菌素抗性选择标记,插入失活，分两次先后选择：,没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。,获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。,外源基因BamH I,Amp中存活,但在Tet中死亡,外源基因Pst I,Tet中存活,但在Amp中死亡,3. pUC系列,University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造

10、而成。属正选择载体。,pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19, 复制起点,pBR322的 ori,但其上失去了克隆位点。, Ampr 基因,（1）元件来源,pBR322的Ampr基因,大肠杆菌-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ基因； 位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。,（2）长度,约2.7kb,（3）克隆位点,10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ基因的5端。,pUC18/19,Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。,（4）选择标

11、记,蓝白斑选择原理：, Xgal,（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside）,-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。,Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,-半乳糖苷酶, -半乳糖苷酶Xgal显色反应：, lacZ的肽互补,1）-肽（ lacZ ）：,-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。,lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,4聚体,2）受体菌lacZ

12、突变（lacZM15）,受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 。,受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a,pUC质粒载体上的lacZ 编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。,C端大部分,N端的11-41aa,pUC lacZ,受体菌lacZ,3）载体lacZ与互补,4）互补的插入失活,pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位 点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成， 但插入外源基因就会阻止LacZ的合

13、成。不 能互补。,lacZ,5,3,肽移码突变,lacZ,5,3,肽,不互补,互补,MCS,外源DNA, IPTG的诱导作用,IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ肽都表达。从而互补。,但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生肽！,IPTG,通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。,MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。,IPTG诱导的结果：,（5）pUC系列载体的优点, 更小的分子量：,如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。, 选择方便,Xgal显色、抗菌素双重直

14、接选择。, 克隆便利,具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。, 测序方便,第二节 噬菌体载体 （Bacteriophage，简称phage） T4 Bacteriophage,一、 噬菌体的一般生物特性 可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。 除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能： 1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环境化学物质的破坏； 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞； 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒； 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒,1. 噬菌体的结构和其核酸类型： 结构：无尾部结构

15、的二十面体型、 具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、 双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。,不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较复杂；对寄主的依赖性较低。 有些噬菌体的DNA碱基不是由标准的A/T/C/G组成的。 Example： T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞嘧啶（HMC）;SP01噬菌体DNA中没有T碱基，取代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。,2、噬菌体的生命周期,噬菌体的溶菌生命周期 噬菌体的溶原生命周期,（1）噬菌体的溶菌生命周期 噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶

16、源周期 只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 烈性噬菌体溶菌生长的基本过程： 1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来,一种典型的烈性噬菌体的生命周期,（2）.噬菌体的溶原生命周期 溶原生长周期： 是指在感染过程中没有产 生出子代 噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上，成 为它的一 个组成部分。具有这种溶原周期的噬菌体,

17、 叫温和噬菌体. 现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期,溶原性噬菌体的生命周期,二、噬菌体载体,（1）长度为48502 bp； （2）双链线性DNA； （3）但在两端有cos位点，可以环化。,DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。,1. DNA分子的特点,cos位点（cohensive-end site）：,噬菌体线性DNA分子的粘性末端及其环化作用,噬菌体和其DNA,2. 噬菌体的基因组特点,噬菌体感染细菌的早期：双链进行型复制。,3. DNA的复制 模型,（1） 型复制,（2）滚环复制,感染的晚期：启动滚环复制机制。,形成多联体DAN分子。,这种多联

18、体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。,三、单链噬菌体载体,M13、f1、fd 噬菌体,单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：,M13 噬菌体,（2）复制型（RF）是双链环状DNA。,1. 单链DNA噬菌体的特点,（3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态 大肠杆菌。并产生噬菌斑。,（5）可产生大量的含有外源DNA插入片 断的单链分子，便于作探针或测序。,（1）+DNA。（ssDNA）,（4）不存在包装限制。,2. M13 噬菌体,RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。,成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也容易提取。,M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。 但M13 DNA

19、可以转染雌性大肠杆菌。,6407 bp。,（2）DNA长度,（3）DNA提纯,（1）寄主,M13序列,（4）M13的生活周期,虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的1/23/4）,M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA,+DNA合成DNA，形成RF dsDNA,DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白,组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞,+DNA,-DNA,mRNA,M13外壳蛋白,组装成子代M13,+DNA,注入大肠杆菌,复制,转录,翻译,+DNA,指导合成,+DNA,200个 RF DNA,每个细胞可以放出约1000个M13颗粒！,3. M13载体的构建：,

20、M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。,（1）克隆区域的选定, 基因间隔区（intergenic region, IG区）,IG区内只有一个 BsuI 切点。,其余9个BsuI限制性位点分布在其它部位。, 酶切位点,M13,J. Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。,在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ（-肽序列)。 利用-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。,（2）加入酶切位点, 在IG区内加入单一内切酶位点,第一个M13载体：M13mp1：,M13 RF,Bs

21、uI不完全消化,各种长度的线性片断,（其中应有只在IG上切开的线性全长M13）,E.coli lac基因的HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ）,连接,M13mp1,JM101宿主,只有在IG区插入lacZ才能存活并现在Xgal上出互补的蓝噬菌斑,与pUC18相同,M13mp18的多克隆位点,4. M13系列载体的优点,（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段,（2） Xgal显色反应，可供直接选择,（3）无包装限制，克隆能力大,（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链,子代M13噬菌体中包含的是单链+DNA。,1 生物学特征 2 噬菌体的侵染 3 噬菌体的DNA分子,噬菌体

22、的生物学特性,噬菌体由正二十面体的蛋白质头部和中空管状的蛋白质尾部组成。头部包含线状染色体DNA，侵染寄主时将自己的DNA注入寄主细菌。 噬菌体属温和噬菌体。,噬菌体的侵染,噬菌体的侵染是溶源侵染，是噬菌体DNA分子在宿主细胞中能够稳定存在，许多噬菌体DNA能整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。 在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体（prophage ）。而携带了原噬菌体的细菌被称为溶源菌（lysogen ） 。, 噬 菌 体 的 侵 染,噬菌体的DNA分子,DNA的分子为49kb, 大多数基因已经测序和定位。至少包括61个基因，其中一部分为噬菌体

23、生命活动的必须基因，另一部分（b2区）可以被外源基因取代而不会影响到噬菌体的正常功能。,噬菌体的DNA分子,DNA在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesive end site）.另外的作用是内切核酸酶的识别序列。,第二节 噬菌体载体,一、噬菌体 二、M13噬菌体 1 M13噬菌体的生物学特征 2 M13噬菌体的侵染 3 M13噬菌体的载体,1. M13噬菌体的生物学特性,M13是线状的大肠杆菌噬菌体，颗粒内含有6 047bp的闭合环状单链DNA基因组，相对小，意味着可供插入的外源DNA 的空间小。 M13单链DNA的复制型（RF，replicative form）是呈双链环形，此时的DNA，不会插入细菌基因组，持续复制，当积累到100-200个拷贝后，噬菌体DNA编码的正链特异结合蛋白很快就阻止了负链的进一步生成，但以负链为模板的正链合成并未受到影响。大量游离的正链DNA很快参入到外壳蛋白中形成了大量新的噬菌体颗粒。,M13 噬 菌 体 的 侵 染,