基因操作原理-孙明.ppt

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1、基 因 操 作 原 理 Principles of Gene Manipulation,绪论,一、什么是基因操作,将在细胞外产生的核酸分子 插入病毒质粒或其它载体系统中 再整合到那些本来不含该类物质的宿主中 从而形成一种新的可连续繁殖的有机体,目的,要求掌握 基因操作中基本的普遍应用的原理 并能自主设计通用操作方法和策略,要求的基础,生物学 生物化学 分子生物学,参考书籍,. Molecular Cloning V2.0, 1989 分子克隆实验指南 2. 基因工程原理 第二版（上册） 吴乃虎 科学出版社 1998/2000 3. 分子生物学试剂产品目录 如 New England BioLa

2、bs,其它 基因及其操作原理 精编分子生物学实验指南 Internet,基因及其产物的共线性,基因及其产物的非共线性,基因的重叠与可变性,二、基因的基本概念,编码区 ORF 启动子 promoter RBS ribosomal binding site 终止区 terminator flanking sequence upstream / downstream Cap/tail,三、基因的基本结构组成,酶切,酶切,连接,转化,筛选,.GAATTC. .CTTAAG.,.G .CTTAA,AATTC. G.,EcoRI,三、基因克隆的通用策略,Chromosome DNA,vector,Reco

3、mbinant plasmids,Target gene,第二章 工具酶,切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记 利用限制性内切酶切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能 获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质,第一节 限制性内切酶,Restriction endonuclease,任何物种都有 排除异物保护自身的防御机制 免疫系统 细菌的限制与修饰系统,限制性内切酶 修饰酶,一、限制与修饰 Restriction and modification,50年代初，发现 host controlled specificity 噬菌体具有代表性和普遍性 其在不同宿主

4、中的转染频率，在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。,E. coli K,E. coli C,EOP=1,EOP=1,EOP=1,EOP=10-4,1. 现象,EOP Efficiency of plate,pfu plaque forming unit,E.coli K E.coli B E.coli C,K B C,1,1,1,10-4,10-4,10-4,10-4,1,1,说明K和B菌株中存在一种限制系统 可排除外来的DNA 10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果 甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5甲基胞嘧啶,2. 限制酶的发现 60年代，限制内切酶和限制酶的概念 1

5、968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶,需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等 有特定的识别位点 但没有特定的切割位点 切割位点达离识别位点1000bp以上,1970年 美国约翰霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 无细胞提取液可降解E.coli DNA 但不能降解自身DNA 即HindII酶,5 .G T Py Pu A C. 3 3C A Pu Py T G. 5,G T C G A C G T T A A C G T C A A C G T T G A C,Y R,5 .G A A

6、 T T C. 3 3C T T A A G. 5,EcoRI,3. 限制酶的命名,宿主 属名第一字母、种名头两个字母 菌株或型号 序号 罗马字 HindII EcoRI,早前 加R, or M 菌株号和序号小写,1986年下半年 发现 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌 3000种酶 200多特异性,3. 限制与修饰系统的种类 亚单位组成, 识别序列的种类, 是否需要辅助因子 分三类(I, II ,III) 也有分四类，IIs类，即II 亚类,(1) type II 93%,识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 3-OH,5-P， 需Mg2+，相应的修饰酶需only

7、SAM 识别序列主要为4-6bp， 或更长且呈二重对称的特殊序列 但有少数酶识别更长的序列或简并序列 切割位置因酶而异，有些是隔开的,R : 一般为同源二聚体, 反向结合 作用在两条链 M: 单体 DNA同时切割, M只作用新链,type IIs 占5% 识别位点非对称, 非间断 4-7bp 切割位点可能在20bp范围内。 R: 与 type II 具有相同的辅助因子要求 M: 通常由两个M来完成,各作用一条链,(2) type I 和 typeIII type I (1%) 种类少 如 EcoR EcoB,R酶和M酶 各作为一个亚基存在于酶分子中 即R基和M亚基，还有负责识别DNA序列的S亚

8、基 分别由hsdR，hsd M，hsdS基因编码 属于同一操纵子（转录单位）,EcoK R2M2S EcoB R2M4S2,P1hsdRP2hsdMhsdS,识别位点 EcoB TGA*(N)8TGCT A* EcoK AAC (N6)GTGC A * 甲基化位点 可能的甲基化位点 切割位点1000bp以外, 无特异性,R-M+突变 M+,S- R- M-,Gene type phenotype,M- R- M- 保全机制,typeIII (1%) EcoP1 EcoP15 识别 AGACC CAGCAG 切割 下游 24-26bp处,DNA,前RNA,mRNA,Intron,(3) I-pr

9、efix 和 PI-prefix,是否为R/M系统中的一个成员?,mRNA,蛋白,活性蛋白,Intein,前提蛋白,Intron / Intein 具相对性,TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGA,37 26bp 识别位于19bp核心上 -12-+7,TAACGGTCCTAAGGTAGCG,I-CeuI 衣滴虫(Chlamydomonas eugametos) 叶绿体大rRNA基因的内含子,The sequence degeneracy tolerated by this enzyme has not yet been determined,65 30bp TGGCAAACAGC

10、TATTATGGGTATTATGGGT,PI-PspI 极端嗜热菌Pyrococcus species GB-D 嗜热DNA聚合酶(Ecoli工程菌) 内切酶是蛋白质体内拼接的产物，在同一个多肽前体上，同时产生聚合酶和该内切酶活性,其它 I-PpoI PI-TliI PI-SceI (VDE),来自 线粒体、叶绿体、核DNA、T偶数噬菌体,4：Sau3AI GATC 5：EcoRII CCWGG W=A or T NciI CC SGG S=C or G 6：EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT,1长度,4、 5、 6,二、限制性内切酶识别的序列,Not I GCGGCCGC

11、 8 BbvCI CCTCAGC 7 PpuMI RGGWCCY 7,R=A or G Y=C or T M=A or C K=G or T S=C or G W=A or T H=A or C or T B=C or G or T V=A or C or G D=A or G or T N=A or C or G or T,6,4Nt=44=256 6Nt=46=4096, 回文对称 4 6 8 5 7,2.结构,EcoRI GAATTC CTTAAG HindIII AAGCTT TTCGAA, 非对称 AccBSI CCGCTC (-3/-3) BssSI CTCGTG,2.结构,Num

12、bers in parentheses indicate point of cleavage for non-palindromic enzymes, 多识别序列 (简并序列) AccI GTMKAC HindII GTYRAC, 间断对称 AlwNI CAGNNNCTG DdeI CTNAG,3切割位置 内部 大多数,AccBSI CCGCTC (-3/-3) GGCGAG,AaaaI NNNNNN (-2/-4) NNNNNN,例, 两端 EcoRII CCWGG Sau3AI GATC NlaIII CATG, 两侧 BcgI (10/12)CGA(N)6TGC(12/10),10(N)

13、CGA(N)6TGC(N)12 12(N)GCT(N)6 ACG(N)10,TspRI CASTGNN/ NNCAC(G)TGNN NNGTG(C)ACNN, 单侧 BbvI GCAGC N(8/12) BspMI ACCTGC (N4) TGGACG(N8),4.特殊系列 I-prefix & pI-prefix,三、限制性内切酶产生的末端,Cohesive terminus (end),1. 匹配粘端(粘性末端） 末端相同, 在对称轴5侧切割底物,DNA双链交错断开5protruding,EcoRI NNGAATTCNN NNCTTAAGNN NNG AATTCNN NNCTTAA GNN

14、, 3-侧3突出末端 5 recessed KpnI GGTACC CCATGG,2.平端 Blunt end 在对称轴上同时切割DNA的两条链 HaeIII GGCC EcoRV GATATC XmnI GAANNNNTTC,3.非对称突出端(相同) 来自非对称识别序列 CCTCAGC BbvCI GGAGTCG, 简并序列 AccI GT/MKAC,GTATAC GTAGAC GTCTAC GTCGAC, 间隔序列 DraIII CACNNNGTG EarI CTC T TC (1/4) GAGAAG,4.同裂酶(isoschizomer) 识别相同序列的限制酶称同裂酶, 同序同切 Hin

15、dII HincII GTY/RAC HpaII HpaII C/CGG MobI Sau3AI /GATC,同功酶？, 同序异切 KpnI GGTAC/C Acc65I G/GTACC Asp718I G/GTACC AatII GACGT/C BsaHI GR/CGYC, “同功多位” EcoRI G/AATTC ApoI R/AATTY HpaI GTT/AAC HincII GTY/RAC, 其它 SalI G/TCGAC AccI GT/MKAC HincII GTY/RAC,5.同尾酶 平端 同裂酶,EcoRI GAATTC MfeI CAATTG ApoI RAATTY SpeI

16、 NheI XbaI StyI,ACTAGT GCTAGC TCTAGA CCWWGG,BamHI GGATCC Sau3AI GATC ClaI ATCGAT AccI GTMKAC pUC19 BstBI TTCGAA TaqI TCGA,四、末端长度对切割的影响,指导双酶切以及酶切 PCR产物,2hr 20hr AccI CCGGTCGACCGG 0 0 HindIII CAAGCTTG 0 0 CCAAGCTTGG 0 0 CCCAAGCTTGGG 10% 75% EcoRI GGAATTCC 90 90,利用Labeled 寡核苷酸 在20 Units RE 时 酶切 1 ug ol

17、igo,1. Labeled 寡核苷酸,PstI GCTGCAGC 0 0 TGCACTGCAGTGCA 10 10 AACTGCAG(N) 14 90 90 CTGCAG(N) 20 0 0,2. DNA片段（线性载体） 10/ug DNA 60min,CGTACG CTCGAG GAATTC CTGCAG GATATC,EcoRI L1TMUS29 XhoI 100% (1) PstI 88(1) CTCGAG GAATTC CTGCAG XhoI EcoRI PstI,.CTCGAGGAATTCCTGCAG. .GAGCTCCTTAAGGACGTC. XhoI EcoRI PstI,Ec

18、oRI initial cut L1TMUS29 cleavage efficiency XhoI 97% 1 base PstI 37% 1 base,XhoI : 1 EcoRI 100% PstI : 1 EcoRI 88%,L1TMU39 NheI 100(1) GGATCC GAATTC GCTAGC BamHI EcoRI NheI,由于不计算单链部分的4个碱基，因此设计引物时应加4个。 在双酶切多克隆位点时， 选酶切秩序,五、位点偏爱 (site preferences),单位酶、在建议使用的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1小时，使1g DNA完全消化所需的酶量(多数情况用

19、 DNA来测试) NEB in 50l 体系/Pharmacia 50l,某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割,1975 EcoRI切割 phage中的5个位点，并不是随机的，靠近右端的位点，比分子中间的位点切割快10倍。 1976 EcoRI在腺病毒2 DNA中的切割速率不同。 1981 EcoRI和HindIII在中的切割速率分别有10倍和14倍的差异 （=48502bp 12bp粘端）,1. 现象,* 1977，X174 ssDNA 5386bp circle HgaI切割某些位点比其它的快,* 1983 腺病毒2中，CTCGAG位点对PaeR7I 完全抵抗 但同裂酶XhoI

20、,却很易切割，原因是5末端有一个CT二核苷酸 与甲基化完全无关,有4个 SacII位点 三个在中央 一个在右臂（Right-terminus） at 40,38bp 中央三个快50倍,NEB检测了许多限制酶，有许多酶的差异在10倍的范围上，但有许多酶有较大的差异 NarI, NaeI SacII GGCGCC, GCCGGC, CCGCGG,(1) pBR322含4个NarI位点 1单位酶 1hr (标准条件) 将两个位点完全切割 但是另外两个位点 50单位,16小时 不能完全切割完全,(2) NaeI在pBR322也有4个位点， 其中两个易切割, 有一个有点慢,第四个慢50倍,在 DNA上它

21、们都有一个位点，但是过量的酶只能完成部分酶切。,酶单位定义是通过切割腺病毒2 DNA来测定的 (A-virus2 有至少10个位点) 1单位NaeI or NarI是切割1g腺病毒2 DNA在50l体系中1hr完全所需的酶量,2. 原因,(1) 在切割DNA之前需要同时与两个识别位点相作用,(2) BspMI、EcoRII、HpaII对它们作用的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是激活另一个的变构位点(allosteric),由顺式方式提供（cis）: 它们相互靠近或可形成环（loop） 由反式方式提供（trans）: 其变构位点由含识别序列的寡核苷酸提供,BspMI难以切割DNA

22、: 在pBR322和pUC18/19中有一个BspMI位点，100倍的过量切割一半DNA未切割,3酶量使用差异,cccDNA / linear DNA 酶量使用有差异,单位酶、在建议使用的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1小时，使1g DNA完全消化所需的酶量,1Unit/1g DNA,少数需酶量少 , 如 AseI : 0.3U 可满足 1g pBR322切割 多数需酶量多 pUC19: AvaI 10u , NarI 20U, ScaI 15U EagI 10U for pBR322 & LITMUS,六、酶切反应条件,任何一个提供商都会标明其产品的最佳作用条件,(一) 缓冲液,1.

23、常规缓冲液,pH, Mg+, DTT, BSA (10X), pH 7.0-7.9 (at 25) Tris-HCl, 乙酸 离子强度： NaCl,高 中 低 100mM 50mM 0, Mg+ 10mM MgCl2 , MgAc DTT (dithiothreitol,二硫苏糖醇) 1mM 100g/ml BSA 少数需要, 乙酸盐缓冲液 其它特用缓冲液，如NEB的U体系,不同酶具有不同Buffer,各公司设立几种常用Buffer,NEBuffer 1 NEBuffer 2 NEBuffer 3 NEBuffer 4,Buffer A Buffer B Buffer H Buffer L,如

24、,2. 通用缓冲体系 Phamacia One-Phor-All buffer plus, OPA+ 谷氨酸钾缓冲液（KGB）,使用浓度不同 0.5 1 1.5 2 ,2：50-80%, 3：正常相当于厂家的活性 4：高于厂家提供的活性,3. 双酶切策略 a. 选用都合适的Buffer or KGB b. 不可替代：先低，加适量NaCl和第二种酶 c. 先低后高（可纯化或不纯化）,4. 注意事项 a. 取少量酶 (方法 or 稀释 ) b. 最后加酶、尽快操作 c. 减少反应体积 d. 反应时间的延长 e. 分装（对于多个反应）,(二) 反应温度 大多数为37, 一部分为50-65 少数25-

25、30 高温作用酶37时活性多数10-50% TaqI (65) 10% , ApoI(50)50% SmaI (25)在 37 half life 15min,(三) 反应时间 1hr or more 许多酶延长其反应时间可减少酶的用量 在16hr反应时间所需正常酶量的比率 EcoRI 0.13 (1/8) HindIII (1/8),KpnI(1/4) BamHI(1/2) HaeIII(1/1),(四) 反应终止 1. EDTA 终10mM 2. 加热 37 酶 在65处理20min, otherwise 80 20min,3. 其它 DNA纯化(苯酚,试剂盒),在80 20min不失活的

26、酶: 37：Bg1II HpaI PvuII 65：Tth111I TspRI 50：Bc1I,七、星星活性(star activity),非特异性切割,在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性,1. 概念,实际上星星活性是限制内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。,ApoI、AseI、BamHI、BssHII、EcoRI、EcoRV、HindIII、Hinf1、KpnI、PstI、PvuII、SalI、ScaI、TaqI、XmnI,2. 酶的特异性变化方式 与酶的种类和所应用的条件有关 最普遍的活性变化: 1个碱基的变化

27、; 识别位点外层碱基的随意性; 以及单链缺口,EcoRI的研究表明 pH的升高和离子强度的降低, 可切割N/AATTN 切割只有一个碱基不同的序列 (但这个变化的碱基在中央序列, 以及 AATT中不是A到T或T至A的变化),3. 引起星星活性的因素 高浓度甘油（5%） 酶过量（100U/g） 低离子强有力度（pH8.0), 有机溶剂 PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(dimethylacetamide)、二甲基甲酰胺(dimethylformamide), sulphalane 用其它二价阳离子代替Mg+ Mn+，Cu+，Co+, Zn+,不同的酶对上述条件的敏感性不一样 P

28、stI比EcoRI对高pH更敏感 但后者对甘油浓度更敏感,星星活性在绝大多数情况下，是可控制的,4. 抑制星星活性的条件（措施） 减少酶的用量，避免过量酶切,减少甘油浓度 保证反应体系中无有机溶济或乙醇 提高离子强度到100150mM (如果不会抑制的话) 降低反应pH至pH7.0 使用Mg+作为二价阳离子,X174 (5386 bases) M13mp18 (7249bases), Wild M13 phage 6407base,八、单链DNA的切割,Cleavage of single-stranded DNA,HinP1I, HhaI, MnlI at 50% of the rate o

29、f dsDNA HaeIII 10% BstNI, DdeI, HgaI, HinfI, TaqI 100倍慢 不切割：AluI, BbvI, DpnI, FnuDII, FokI, HpaII, HphI, MobI, MobII, MspI, Sau3AI, SfaNI,1. 外因 反应条件 底物的纯度(杂质, 污染-盐-酚),九、影响活性的因素,2. “内因” 星星活性 甲基化 底物的构象/位点,1. 产生的5突出端补平后连接 EcoRI GAATTC CTTAAG,十、酶切位点的引入 （酶切水平）,.CTCGAGGAATTCCTGCAG. .GAGCTCCTTAAGGACGTC. Xh

30、oI EcoRI PstI,.CTCGAGG AATTCCTGCAG. .GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI,.CTCGAGG AATTCCTGCAG. .GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI,AATT,TTAA,.CTCGAGGAATTAATTCCTGCAG. .GAGCTCCTTAATTAAGGACGTC. XhoI PstI,AseI,XmnI,酶切 补平 连接,HindIII AAGCTAGCTT TTCGATCGAA,AluI,NheI,2. 同尾末端的连接 BamHI(G/GATCC) + BclI (T/GATCA) AlwI (

31、GGATC 4/5),3.平端连接 PvuII(CAGCTG)+EcoRV(GATATC) MobI (GATC),十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性,GC%,酶切位点出现的机率,BamHI GGATCC,EcoRI GAATTC,在基因组中，碱基对的排列是非均匀的 因此尽管GC含量相同的酶切位点，在基因组中出现的机率是不一样的,平均片段大小在E.coli AscI(GGCGCGCC) 20kb NotI(GCGGCCGC) 200kb EcoRI/HindIII 5kb SpeI(ACTAGT) 60kb,细菌基因组 在大多数富含A+T的细菌中，CCG和CGG的排列是最少见的，所以含有这

32、两种序列的识别序列出现的机率就非常少,酵母基因组 G+C%为38%，因此在重复序列之外(tRNA or Ty elements)，富含G+C的识别序列就特别少,哺乳动物 细胞核基因组的G+C为41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位点在哺乳动物细胞就相当稀少。 但是在哺乳动物细胞中，大多数CG序列是甲基化的,第二节 甲基化酶 Methylase,Methylation,一、甲基化酶的种类,在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶，,在E.coli中大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶,1. Dam甲基化酶,识别位点GATC, 在腺嘌呤N6位置 引入甲基,PvuII Ba

33、mHI BclI BglII XhoII MboI Sau3AI 识别位点中含GATC序列 ClaI(1/4) XbaI (1/16) TaqI (1/16) MboII (1/16) HphI(1/16) 部分识别序列含GATC序列 4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列,有些限制酶对Dam甲基化敏感 不能切割相应的序列 BclI, ClaI, MboI, XbaI 等 不敏感的有 BamHI, Sau3AI, BglII, PvuI等,一般哺乳动物DNA 不会在A-N6上甲基化 当需要在敏感位点上完全切割DNA时，必须从dam- E.coli中提取DNA,2. Dcm甲基化酶,识

34、别CCAGG或CCTGG序列 在第二个C上C5位置上引入甲基,EcoRII / BstNI CCA(T)GG 二者识别序列相同，但切点不同 EcoRII受dcm甲基化作用影响 BstNI可避免这一影响,受影响酶有： Acc65I GGTACC AlwNI ApaI GGGCCC EcoRII EaeI 等,不受影响酶有： KpnI GGTACC BanII Bg1I BstNI NarI GGCGCC 等,3. EcoKI甲基化酶,识别AAC(N)6GTGC GCAC(N)6GTT 但识别位点少(1/8kb) 研究较少 而dam（1/256bp） dcm(1/512bp),4. SssI甲基化

35、酶,来自原核生物Spiroplasma,CG序列中的C在C5位置上甲基化,可在未甲基化或半甲基化链上起作用,A的 N6位置,许多酶对此甲基化敏感 AatII ClaI XhoI SalI等 不敏感的有BamHI EcoRI SphI KpnI,SssI甲基化的DNA 受E.coli McrA, McrBC, Mrr 系统的限制,5. 其它甲基化酶,二、依赖于甲基化的限制系统,E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统 识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列,mcrA, mcrBC, mrr,都限制由 CpG甲基化酶(MSssI)作用的DNA,Mrr也限制m6A,McrBC 切割两套位

36、点（G/A）mC，这两套位点之间间隔2kb，最适为55103bp，需GTP,大多数常用的E.coli受体都含这三个限制系统 三个都不限制Dam, EcoKI , EcoRI修饰的位点 McrA限制HpaII甲基化修饰的位点,三、甲基化对限制酶切的影响,1. 修饰酶切位点, HincII GTCGAC GTCAAC GTTGAC GTTAAC,M.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI处理DNA后，GTCGAC将不受HincII切割, BamHI GGATCC M.MspI m5CCGG 如果BamHI前面为CC或后面为GG， 那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割, 构建DN

37、A文库时 用AluI(AGCT)和HaeIII(GGCC)部分消化基因组DNA M.EcoRI甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRI接头 当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割,2. 产生新酶切位点 TCGATCGA AGCTAGCT TaqI TaqI M.TaqI TCGA*TCGA* *AGCTAGCT DpnI,3. 用于研究细胞DNA中位点特异性甲基化的水平及分布 哺乳动物m5CG、植物的m5CG，m5CNG 肠道细胞的Gm6ATC C m5/4 CGG MspI可切割，HpaII不可切割Gm6ATC Sau3AI 可切割，MobI不可切割 其它,4. 对基因组作图的影响,

38、在哺乳动物DNA CpG序列出现的频率大约只有预计的1/5 含CpG序列的识别序列极其稀少,大多数CpG都发生甲基化 含CpG的所有识别序列的酶不能切割,CpG甲基化大多数不完全 对酶切位点稀少的酶来说 在其识别位点上的甲基化具可变性,第三节 DNA聚合酶,DNA polymerase,催化DNA的合成(模板/引物/dNTP等)及其相辅的活性,一、大肠杆菌DNA聚合酶I,真核细胞有 4种 DNApoly ：也许是复合物，位于细胞核内，有催化细胞增生的作用。 ：小分子蛋白质（4.4kDa）曾从小牛胸腺出大是出，与细胞增生无关。 ：100kDa，利用RNA为模板的效率比利用DNA为模板的效率高。

39、其它：线粒体DNA聚合酶、催化线粒体DNA的合成。,原核细胞三种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关 I单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长 II 与低分子脱氧核苷酸链的延长有关 III 在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶,1. 活性,单链多肽(109kDa) 三种活性, 53DNA聚合酶活性 底物: 模板(ssDNA), 引物（带3OH基） 或 5突出DsDNA,Mg2+ dNTP DNApolyI,53外切核酸酶活性 底物: dsDNA or DNA: RNA杂交体 活性：从5端降解dsDNA，也降解 RNA:DNA中的RNA(RNase H活性),Mg2+ DNApol

40、yI,+ dNTP,35外切酶活性 底物：3-OH dsDNA or ssDNA 活性：从3-OH端降解DNA，可被53聚合活性封闭。,Mg2+ DNApolyI,+ dNTP,Mg2+ DNApolyI,+ dNTP,Proof reading,反应平衡,过量dNTP 平端,2. 用途 切口平移法标记DNA （所有DNApoly中只有该酶有此活性）,Mg2+, 低限量DNase I,dNTP DNApoly I,产生切口,切口平移外切活性和合成活性共同作用使切口沿5-3方向平移,若有放射性dNTP, 则可标记成探针, 用于cDNA克隆中的第二链 即单纯的DNA聚合活性 但由于有5-3外切活性

41、，已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶, 末端标记 （ 交换或置换反应）,Mg2+, DNApoly I -P32dATP,A* T,T4 DNApoly T7 DNApoly 更好,二、Klenow酶,E.coli DNA polymerase I large fragment Klenow fragment,在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解, 从全酶中除去53外切活性片段，而聚合活性和35外切活性不受影响，或基因工程而得 76kDa,1. 活性 共两种, 同 DNApoly I,2.作用 补平3凹端，注意要用 dNTP 抹平3凸端，注意必须加足量dNTP T4和T7具更强3-5外切活性

42、，被取代 末端标记 A置换反应 同前,同样被 T4 poly 代替 B补平3-凹端的过程进行标记, cDNA克隆中合成第二链 随机引物标记 DNA测序（Sanger 双脱氧链末端终止法）被T7取代，Taq等PCR酶。 PCR反应被Taq等取代 在体外诱变中，用于从单链模板合成dsDNA,仅利用DNA合成活性,三、T4噬菌体DNA聚合酶,T4 DNA polymerase,来源于T4 phage感染的E.coli, 114kDa,1. 活性 与Klenow酶相似, 但35外切活性强200倍 不从单链DNA模板上置换引物 因此在诱变反应中更有用,2. 用途 补平或标记3 凹端 必须有高浓度dNTP

43、（末端标记） 置换反应 必须有高浓度dNTP(一种),末端标记, 标记DNA片段 即利用外切活性产生了3凹端 再补平（用标记的dNTP）,与切口平移相比有两大优点： 不产生发夹结构 经限制酶切割后易变成链特异性探针 缺点：标记不均匀，且35外切活性强且快，当外切至中点时必须终止，否则变成二单链，而被降解, 将dsDNA变成平端，需高浓度dNTP 定点诱变 在ssDNAdsDNA过程中 由于T4不置换引物，效率提高1倍。,四、T7噬菌体DNA聚合酶,T7 DNA polymerase,来源于T7 phage感染的E.coli,为两种紧密结合的蛋白质复合体(基因5蛋白和宿主的硫氧还蛋白),T7DN

44、Apoly为持续合成能力最强的一个 平均长度要大得多,在测序时具有优势 活性/功能与T4DNApoly、Klenow类似 但3 5外切活性长Klenow的1000倍,修饰的 T7 DNA polymerase 99% 3-5外切活性被除去（Version1.0） 完全除去（V2.0） 用于测序反应（测序酶） Sequenase USB Biochemical,用途: A.替代T4的功能 B.长模板的引物延伸,五、耐热DNA聚合酶,简略，详见PCR Taq,Vent,Pfu,Pwo,Tth 等,六、反转录酶 Reverse transcriptase,依赖于RNA的DNA聚合酶,1种类 来自 A

45、MV 禽成髓细胞瘤病毒 Mo-MLV(或称M-MuLV) Moloney鼠白血病病毒,5 3合成DNA 无3 5外切活性, AMV 二链多肽(62kDa/94kDa), 具5 3DNA聚合活性 具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA),在反应开始时,引物和mRNA模板杂交体可成为 RNase H 的底物, 此时模板的降解和cDNA的合成相竞争,反应终止时，Rnase H 可在正在增长的 DNA链近3端切割模板 趋向于抑制cDNA的产量并限制其长度,但在42(鸡的正常体温),能有效发挥DNA合成作用，能有效地拷贝较复杂的mRNA 早期提纯过程中易被内切酶污染, cDNA不超过1kb,现已解决, M-Mulv 单肽 84kDa RNase H 活性弱 利于合成较长cDNA 纯度高 工程产品 42失活,2用途 cDNA克隆 测转录起始点（引物延伸法） 5突出DNA的补平 测序反应,当用DNApolyI,Klenow或测序酶不理想时 其它 RT-PCR RNA二级结构,3. 活性